Автореферат диссертации (Мосин О.В.)
Мосин Олег Викторович
Разработка способов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н (D) И 13С, с высочайшими степенями изотопного обогащения.
03.00.23-Биотехнология
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата хим наук
Москва -1996
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Столичной ордена Трудового Красноватого Знамени Гос академии узкой хим технологии им. М.В. Ломоносова.
Научные руководители:
доктор хим наук, доктор, член корреспондент РАМН, В. И. ШВЕЦ, кандидат био наук, старший научный сотрудник Д. А. СКЛАДНЕВ.
Официальные оппоненты:
доктор хим наук, доктор Н. Ф. МЯСОЕДОВ.
кандидат хим наук, ведущий научный сотрудник Б. М. ПОЛАНУЕР.
Ведущая организация:
Муниципальный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ «ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛОК».
Защита диссертации свершилась 24 мая 1996 г в 15.00 на
заседании Диссертационного совета Д 063. 41. 01 в Столичной Гос академии узкой хим технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 1S7571, Москва, пр-т Вернадского, дом 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Столичной Гос академии узкой хим технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1.
Автореферат разослан:_____ апреля 1996 г
Учёный секретарь Диссертационного Совета,
Кандидат хим наук, старший научный сотрудник
А. И. Лютик
Общая черта работы
Актуальность работы. В текущее время в мире вырастает энтузиазм к природным соединениям, меченным размеренными изотопами, а именно дейтерием (D) и углеродом 13С, которые неподменны для разнопрофильных биомедицинских и исследовательских целей, структурно-функциональных исследовательских работ, также для исследования клеточного метаболизма различных на биологическом уровне активных соединений (БАС) с внедрением размеренных изотопов.
Тенденции к применению размеренных изотопов по сопоставлению с их радиоактивными аналогами обоснованы отсутствием радиационной угрозы и возможностью определения локализации метки в молекуле способами высочайшего разрешения: спектроскопией ядерного ЯМР, ИК- и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие этих современных способов за последние годы позволило усовершенствовать проведение бессчетных био исследовательских работ de novo, также учить структуру и механизм деяния клеточных БАС на молекулярном уровне. Часто для данных исследовательских работ нужно, чтоб молекулы синтезируемых БАС имели как можно более высочайшие степени изотопного обогащения.
Вот поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС с высочайшими степенями изотопного обогащения является очень животрепещущей задачей для современной биотехнологии и российскей микробиологической индустрии. С развитием новых биотехнологических подходов в ближайшее время появилась возможность получать различные размеренно меченые соединения за счёт био конверсии сравнимо дешёвых дейтерированных субстратов дейтерометанола и тяжёлой воды (CD3OD/D2O) в на генном уровне сконструированных штаммах микробов (О.В. Мосин, Д.А. Складнев). Но опробированные в лабораторных критериях процессы изредка используются в биотехнологии из-за наличия ряда проблем, связанных с клеточной адаптацией к тяжёлой воде (D2O).
Явление адаптации к тяжёлой воде любопытно не только лишь с научной точки зрения, но оно также позволяет получать уникальный био материал, очень удачный для решения задач молекулярной организации клеточки при помощи способа ЯМР-спектроскопии. Перечисленные выше данные послужили основой для выбора объектов исследования в наших опытах. Ими являлись на генном уровне маркированные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к разным таксономическим родам микробов: факультативные метилотрофные бактерии Brevibacterium meihylicurn, облигатные метилотрофные бактерии Methylobactllus flagettatum, галобактерии Halobacterium halobium и хемогетеротрофные бактерии Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.
Реальная работа выполнена на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках научно-технической программки Наукоёмкие хим технологии.
Целью данной работы была разработка способов биотехнологического получения молекул аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высочайшими степенями изотопного обогащения.
Так как биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счёт конверсии тяжёлой воды к началу проведения данной работы был исследован недостаточно, в рамках работы представляло энтузиазм исследование принципной способности их адаптации к росту на средах содержащих тяжёлую воду для синтеза меченных мотивированных товаров. Для этого были разработаны особые биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации всеохватывающего использования хим компонент биомассы приобретенных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных микробиологических производств по получению изотопно-меченных БАС на их базе.
Научная новизна работы заключается в последующих качествах:
- Предложен способ получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к наибольшим концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде.
- Показана перспективность использования суммарных хим компонент биомассы метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum, приобретенных в итоге многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для биосинтеза дейтерий-меченных молекул аминокислот, белков и нуклеозидов.
- Разработаны способы получения изотопно-меченных молекул БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, приспособленных к росту и биосинтезу на средах с высочайшими концентрациями тяжёлой воды. Получены с высочайшими выходами личные дейтерий- и 13С-меченые аминокислоты – аланин, валин, лейцин/изолейцин и фенилаланин (степени изотопного включения в молекулы составляют до 97,5% от полного количества атомов водорода в молекуле); [1,3′,4′,2,8-D5]-инозин (степень включения дейтерия в молекулу 62,5% от полного количества атомов водорода в молекуле) и дейтерий-меченный трансмембранный белок бактериородопсин с селективным и униформным нравом включения метки в молекуле.
- Разработаны общие принципы масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения мультикомпонентных консистенций аминокислот при данном способе введения метки за счёт внедрения прямой обработки (дериватизации) культуральной воды и белковых гидролизатов дансилхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.
Практическая значимость: Приобретенные в работе результаты могут быть применены для сотворения новых безотходных производств по синтезу изотопно-меченных молекул БАС. А именно, основанных на использовании био конверсии дешёвых меченных низкомолекулярных субстратов в дорогостоящие клеточные БАС.
На метод получения униформно-меченного дейтерием L-Phe имеется положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче авторского свидетельства № 055610 от 17.11.1995 г на заявку № 930558240 от 15.12.1993 г. На метод получения [1,2′,41,2,8-D5]-инозина оформлена заявка № 95118778 от 14.11.1995 г.
Положения, выносимые на защиту:
- Подбор условий получения биомассы штамма факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum с униформным нравом мечения молекул клеточных БАС дейтерием. Внедрение гидролизатов дейтеро-биомассы данного штамма для биосинтеза дейтсрий-меченного инозина и бактериородопсина.
- Способы получения D- и 13С-аминокислот, [1′,3′,4′,2,8-D5]инозина и бактериородопсина за счёт био конверсии СD3ОD/13СН3ОН и D2O.
- Способ прямой химической модификации интактных культуральных жидкостей дансиллхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном. Применение данного метода для масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения молекул аминокислот в составе мультикомпонентных консистенций при данном методе введения изотопной метки в молекулы.
Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались и дискуссировались на 3-м международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и их аналогам (Вена, август, 1993), на 4-й Всероссийской научной конференции «Трудности теоретической и экспериментальной химии» (Екатеринбург, апрель, 1994), 6-й интернациональной конференции по ретинальным белкам (Ляйден, июнь, 1994), 7-м международном симпозиуме по генетике промышленных штаммов микробов (Монреаль, июль, 1994), 8-м международном симпозиуме по микробному росту на C1-соединениях (Сан-Диего, август, 1995), Евроазийском симпозиуме по современным фронтам в биотехнологии (Анкара, ноябрь, 1995).
Публикации. По материалам диссертационной работы размещено девять печатных работ и 6 тезисов научных конференций.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, выводов. Работа изложена на 120 страничках машинописного текста, содержит 17 рисунков и 15 таблиц.
Материалы и способы
Бактериальные штаммы и питательные среды. Исследования проводили с на генном уровне маркированными штаммами-продуцентами аминокислот, белков и нуклеозидов:
Штамм №l. – Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652 (leu), штамм факультативных метилотрофных микробов, продуцент L-фенилаланина.
Штамм №2. – Methylobacillus flagellatum КТ (ile), штамм облигатных метилотрофных микробов, продуцент L-лейцина.
Штамм №3. – Bacillus subtilis (his, tyr, ade, иrа), штамм хемогетеротрофных микробов, продуцент инозина.
Штамм №4. – Bacillus amyloliquefacien (ade, иrа), штамм хемогетеротрофных микробов, продуцент тимидина.
Штамм №5. – Halobacterium halobium ET 1001, пигментсодержащий штамм экстремальных фотоорганогетеротрофных галобактерий, синтезирующих трансмембранный белок бактериородопсин.
В работе использовали последующие питательные среды:
- Малая среда М9 (Miller J., 1976). Среду использовали для ферментации штаммов №1 и №2 и выделения отдельных колоний в критериях адаптации к D2O.
- Всеохватывающая ферментационная среда (ФМ-среда) (Казаринова Л.А, 1980). Среду использовали для ферментации штаммов №3 и №4.
- Синтетическая среда TS (Gibson Т., 1962). Среду использовали для ферментации штамма №5.
Условия адаптации и культивирования микробов на дейтерий-содержащих средах. Адаптацию клеток к дейтерию проводили на твёрдых агаризованных средах (2 %-ный агар) с тяжеленной водой. При всем этом использовали как обычный рассев культур до отдельных колоний на средах, приготовленных из 99,9 ат.% D2O, так и многостадийную адаптацию микробов на средах, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации D2O.
Для биосинтеза меченных БАС использовали среды тех же составов, приготовленные на базе тяжёлой воды и дейтерометанола (D2О/СD3ОD) с внедрением безводных реагентов. Полученную таким макаром биомассу В. mehylicum гидролизовали в 1 н. DCl и использовали в качестве источника суммарных ростовых причин для культивирования штаммов №3 и №5 соответственно.
13С-аминокислоты были получены за счёт конверсии 13СН3ОН в метилотрофных микробах M. flagellatum.
Для введения дейтерия в молекулу бактериородопсина использовали синтетическую среду TS, в какой ароматичные аминокислоты – L-Phe, L-Tyr и L-Тrр были замещены их дейтерированными аналогами – L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp.
Способы выделения и анализа изотопно-меченых БАС. Экстракцию липидов проводили консистенцией хлороформ–метанол (2:1) по способу Блайера и Дайера (Bligh E.G., Dyer W.J, 1959).
Определение содержания глюкозы в культуральной воды проводили глюкозооксидазным способом (Beyrich Т., 1965).
Бактериородопсин выделяли из пурпуровых мембран Н. halobium ET 1001 по измененному способу Остерхельда и Стохениуса (Oesterhdt О., Stohenius, 1976).
Гидролиз белка проводили с внедрением 4 н. Ва(ОН)2 и 6 н. DCl ( в D2О) (110 °С, 24 ч).
N-Cbz-производные аминокислот получали в процессе реакции Шоттена-Баумана (GreensteinJ., Winitz M., 1961).
N-Dns-производные аминокислот получали по способу Греема и Хартли (GreemB., Hartly В, 1963).
Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот получали по способу Физера (Fiser J., 1963).
Аналитическое и препаративное разделение N-Cbz-производных аминокислот проводили способом ОФ ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т.А. (Егорова Т.А., 1993).
Разделение метиловых эфиров N-Dns-аминокислот проводили на жидкостном хроматографе Кпаиеr (ФРГ), снабженным УФ-детектором и интегратором C-R 3А (Shirnadzu, Япония). Недвижная фаза: Separon SGX С 18,1 мкм, 150?3,3 мм (Kova, Чехословакия). Использовали градиентное элюирование растворителями: (А) – ацетонитрил–трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) – ацетонитрил (от 20% В до 100% В 30 мин, при 100% В 5 мин, от 100% В до 20% В 2 мин, при 20% В 10 мин),
Ионнообменную хроматографию проводили па приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ), 230?3,2 мм, рабочее давление – 50–60 атм, скорость подачи буфера – 18,5 мл/ч, нингидрина – 9,25 мл/ч, детекция при 570 нм и 440 нм.
Масс-спектры электрического удара (ЭУ) получены на приборе МВ-80А (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. Масс-спектры FAB получены на приборе MBA (Hitachi, Япония) при ионном токе 0,6–0,8 мА.
Результаты и обсуждение. 1. Получение штаммов-продуцентов бас, приспособленных к росту и биосинтезу на средах с наивысшими концентрациями тяжёлой воды.
Адаптация облигатных метилотрофных микробов М. flagellatum. В связи с значимостью препаративного нюанса получения дейтерий-меченных соединений в рамках данной работы была исследована возможность адаптации разных штаммов-продуцентов БАС к росту на средах с наивысшими концентрациями тяжеленной воды. Для этого были испытаны представители разных таксономических групп метилотрофных микробов, имеющихся в коллекции ГосНИИ Генетики: L-лейцин-продуцирующий штамм облигатных метилотрофных микробов М. flagellatum (ileu), реализующий 2-кето-3-дезокси-6-фосфогдюконат-альдолазный (КДФГ) вариант рибулёзо-5-монофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции углерода и L-фенилаланин-продуцирующий штамм факультативных метилотрофных микробов В. methylicum (leu), ассимилирующий метанол по РМФ-циклу.
Для проведения адаптации был избран ступенчатый режим роста концентрации тяжёлой воды в ростовых средах, потому что мы представили, что постепенное привыкание организма к тяжёлой воде будет оказывать подходящий эффект на характеристики микробного роста. При всем этом штамм М. flagellatum нашел завышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование роста микробов наблюдалось при концентрациях D2О в среде 74,5 об.%. Данный штамм метилотрофных микробов удалось адаптировать только к 74,5 об.% D2О. В связи с этим, в опытах по исследованию уровней включения дейтерия в аминокислоты использовали эталоны культуральной воды и биомассы М. flagellatum, приобретенные со среды, содержащей 74,5 об.% D2O. Концентрация CD3OD в среде культивирования составляла 1 об.%.
Адаптация факультативных метилотрофных микробов В. methylicum. Пробы адаптировать штамм В. methylicum к росту при сохранении возможности к биосинтезу L-фенилаланина на очень дейтерированной среде с 98 об.% D2O и 2 об.% СD3OD привели к хотимому результату. К данному штамму метилотрофных микробов был применён разработанный специально нами подход по адаптации, который заключался в серии из 5 адаптационных рассевов начальной культуры на агаризованных средах (с добавкой 2 об.% CD3OD) при ступенчатом увеличении концентраций тяжёлой воды (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 об% до 98 об% D2O) и следующей селекции устойчивых к тяжёлой воде колоний микробов. При всем этом поочередно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих тяжёлую воду. Потом их пересевали на среды с большей степенью дейтерированпости, включая среду с 98 об.% D2O (степень выживаемости микробов на конечной стопроцентно дейтерированной среде составляет менее 40%).
Приобретенный итог в опытах по адаптации В. methylicum к тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты его биомассы, также саму биомассу, полученную в процессе многоступенчатой адаптации к D2O в качестве всеполноценных ростовых субстратов для выкармливания штаммов хемогетеротрофных микробов В. subtillis и В. amytoliquefaciens, также штамма галобактерий Н. halobium ET1001.
Адаптация хемогетеротрофных микробов B. subtittis и В. amyloliqucfaciens. В последующих опытах была изучена способность к росту на тяжёлой воде штаммов хемогетеротрофных микробов В. subtillis (his, tyr, ade, иrа), и В. amyloliquefaciens (ade, иrа), продуцентов инозина и тимидина, соответственно. Мы представили, что замедление роста микробов на малых средах, содержащих тяжёлую воду могло быть обосновано возникновением ауксотрофности по отдельным ростовым факторам. Чтоб проверить это предположение, в предстоящем мы использовали всеохватывающие среды. Как и предполагалось, обе культуры удалось адаптировать к дейтерию оковём рассева на твёрдые среды, приготовленные из 99,9 ат.% D2O. Они сходу нашли обычный рост на тяжёлой воде. У штаммов В. subtilis и В. amyloliquefaciens при росте на D2O было отмечено сохранение высочайшего уровня продукции по инозину и тимидину (3,9 и 3,0 г/л соответственно).
Адаптация галобактерий Н. halobium ET 1001. В случае с Н. halobium ET 1001 адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99,9 ат.% D2O оковём рассева штамма до отдельных колоний, так и на водянистой среде с D2O. В обыденных для этой бактерии критериях культивирования (37 oС, на свету) в клеточках синтезировался фиолетовый пигмент по спектральным чертам не отличающийся от природного бактериородопсина.
2. Исследование роста и биосинтеза бас приобретенными штаммами
Исследование ростовых черт М. flagellatum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O, также 13СН3ОН. Данные по росту штамма М. flagellatum на малых средах М9 с добавкой 1 об.% СН3ОН и его меченных аналогов (СD3OD/13СН3ОН) и содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжеленной воды приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Воздействие изотопного состава среды М9 на рост штамма M. flagelaum*.
Номер опыта
Составляющие среды, об.%
Величина лаг-периода, ч
Время генерации, ч
Выход биомассы. % от контроля
Н2О
D2О
СН3ОН
СD3ОD
1
99,0
0
1,0
0
0
1,1
100
2
99,0
0
0,5
0,5
0,2
0,8
91,0
3
99,0
0
0
1,0
0,8
1,0
81,0
4
49,5
49,5
1,0
0
2,4
1,4
76,0
5
49,5
49,5
0,5
0,5
5,7
1,2
75,0
6
49,5
49,5
0
1,0
6,7
1,3
70,0
7
24,5
74,5
1,0
0
5,6
1,4
29,0
8
99,0
0
1,0
13СН3ОН
0
0,1
1,0
72,0
Примечание: *Данные опытов 1–7 приведены для M. flagellatum при выращивании на аква средах М9, содержащих 0,5–1% СН3ОН/СD3ОD и обозначенное количество (об.%) D2О. Данные опыта 7 приведены для приспособленной к наибольшему содержанию дейтерия в среде бактерии M. flagellatum при выращивании в среде М9, содержащей 1% СD3ОD и 74,5% D2О. Данные опыта 8 приведены для при выращивании M. flagellatum в среде М9, содержащей 1% 13СН3ОН. В качестве контроля использовали опыт 1, где использовали протонированную среду М9 с обыкновенной водой и метанолом.
Как видно из таблицы 1, на средах, содержащих тяжёлую воду и изотопные аналоги метанола – CD3OD и 13CH3OH, выходы микробной биомассы составили 81% и 72% соответственно, а на средах с 74,5 об.% D2O выход биомассы составил 29%, что в 3,4 раза ниже, чем в контрольных опытах, когда использовали обыденную воду и СН3ОН (табл. 1, опыты 1, 3, 8). Как видно, способность к росту у М. flagellatum сохранялась только в среде, содержащей 74,5 об.% D2O. Выше этой концентрации наблюдалось ингибирование скорости микробного роста.
Как надо из литературных данных (Складнее Д. А, 1990), введение размеренного изотопа углерода 13С не приводит к смертельным последствиям для клеточки, что мы и следили в случае с М. flagellatum. В целом, приобретенные для М. flagellatum данные могут свидетельствовать о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой спецификой метилотрофных микробов, так и особенностями их метаболизма. Не считая этого, из таблицы 1 следует, что данный подход можно отлично использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (дейтерий и изотоп углерода 13C).
Исследование ростовых и биосинтетических черт B. methylicum на средах, содержащих CH3OH/CD3OD и D2O. Данные по росту начального и приспособленного к тяжёлой воде штамма В. methylicum и наибольшему уровню скопления L-фенилаланина в культуральной воды на малых средах М9 с добавкой 2 об.% СН3OН и его дейтерированного аналога CD3OD, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды, представлены в таблице 2.
Как видно из табл. 2, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов длительность лаг-периода не превосходила 24 ч (см. табл. 2, опыт 1). С повышением концентрации тяжёлой воды в среде длительность лаг-периода увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% D2О и 2 об.% CD3OD (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что продолжительность времени клеточной генерации с повышением степени изотопного насыщения среды дейтерием равномерно возрастает, достигая 4,9 часов на очень дейтерированной среде (табл. 2, опыт 10).
Таблица 2.
Воздействие изотопного состава среды М9 на рост штамма В. mehylicum и уровень скопления L-Phe в культуральной воды*.
Номер опыта
Составляющие среды, об.%
Величина лаг-периода, ч
Выход биомассы. % от контроля
Время генерации, ч
Выход L-Phe, % от контроля
Н2О
D2О
СН3ОН
СD3ОD
1
98,0
0
2
0
24,0
100
2,2
100
2
98,0
0
0
2
30,3
92,3
2,4
99,1
3
73,5
24,5
2
0
32,1
90,6
2,4
96,3
4
73,5
24,5
0
2
34,7
85,9
2,4
97,1
5
49,0
49,0
2
0
40,5
70,1
3,0
98,0
6
49,0
49,0
0
2
44,2
60,5
3,2
98,8
7
24,5
73,5
2
0
45,8
56,4
3,5
90,4
8
24,5
73,5
0
2
49,0
47,2
3,8
87,6
9
0
98,0
2
0
60,5
32,9
4,4
79,5
10
0
98,0
0
2
64,4
30,1
4,9
71,5
10’
0
98,0
0
2
39,9
87,2
2,9
95,0
Примечание: *Данные (1–10) приведены для В. methylicum, не приспособленного к средам с высочайшим содержанием дейтерия. Данные 10’ приведены для приспособленного В. methylicum.
CD3OD не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал воздействия на выход микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% D2О микробный рост угнетался (табл. 2, опыты 2, 4, 6, 8, 10). Так, на среде, содержащей 98 об.% D2О и 2 об.% СD3ОD, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза по сопоставлению с контролем. Принципиально то, что выход микробной биомассы и уровень скопления L-фенилаланина в культуральной воды при росте приспособленного к тяжёлой воде штамма В. methylicum в стопроцентно дейтерированной среде меняются по сопоставлению с контрольными критериями на 12,8% и 5% соответственно, при увеличении времени генерации до 2,8 ч, а длительности лаг-периода до 40 ч (табл. 2, опыт 10’).
Приспособленный штамм ворачивался к нормальному росту при переносе в протонированную среду М9 после пролонгированного лаг-периода, что обосновывает фенотипическую природу парадокса адаптации, что наблюдалось для других приспособленных нами штаммов микробов. Усовершенствованные ростовые свойства приспособленного метилотрофа значительно упрощают схему получения дейтеро-биомассы, хорошим условиям которой удовлетворяет очень дейтерированная среда М9 с 98% D2О и 2% CD3OD (инкубационный период ~5–6 сут при 35 0С).
Исследование биосинтеза L-фенилаланина штаммом В. methylicum. Общей особенностью биосинтеза L-Phe в протонированных малых средах М9 было существенное повышение его продукции на ранешней фазе экспоненциального роста В. methylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (рис. 1).
Рис. 1. Динамики роста В. methylicum (la, 1б, 1в) и скопления L-Phe в культуральной воды (2а, 2б, 2в) на средах с разным изотопным составом: а – начальный мельчайший организм на протонированной среде М9; б – приспособленный мельчайший организм на стопроцентно дейтерированной среде; в – неадаптированный мельчайший организм на стопроцентно дейтерированной среде.
Во всех изотопных опытах наблюдалось ингибирование биосинтеза L-фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и понижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопичному исследованию возрастающей популяции микробов, наблюдаемый нрав динамики секреции L-Phe не коррелировал с высококачественными переменами ростовых черт культуры на разных стадиях роста, что служило доказательством морфологической однородности микробной популяции. Вероятнее всего, накопленый в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Не считая того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить оборотное перевоплощение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза (фенилпируват), что отмечено в работах других создателей (Ворошилова Э.Б., Гусятипер М.М., 1989). За счёт использования данного штамма В. methylicum удалось получить около 1 г дейтерий-меченного L-Phe из 1 л среды. Данные по исследованию культуральной воды способом ТСХ проявили, что не считая фенилаланина штамм B. methylicum синтезирует и копит в КЖ (на уровне 6–10 ммоль) метаболически связанные аминокислоты (аланин, валин, лейцин, изолейцин), присутствие которых подтверждалось масс-спектрометрическим анализом ЭУ производных аминокислот культуральной воды.
Исследование высококачественного и количественного состава внутриклеточных углеводов В. subtilis. В процессе выполнения работы был исследован высококачественный и количественный состав внутриклеточных углеводов при росте В. subtilis на среде с 99,9 ат.% D2О (табл. 3).
Таблица 3.
Высококачественный и количественный состав внутриклеточных углеводов В. subtilis при росте на 99,9% тяжёлой воде.
Углевод
Содержание в биомассе, в % от сухого веса 1 г биомассы
Уровень дейтерированности, %
Протонированный эталон (контроль)*
Эталон, приобретенный в D2O-среде
Глюкоза
20,01
21,40
80,6
Фруктоза
6,12
6,82
85,5
Рамноза
2,91
3,47
90,3
Арабиноза
3,26
3,69
90,7
Мальтоза
15,30
11,62
—
Сахароза
8,62
не детектировалась
—
Примечание:* В качестве контроля использовали гидролизат биомассы B. subtilis, приобретенный в Н2О-среде. Прочерк значит отсутствие данных.
Фракция внутриклеточных углеводов в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюирования с колонки) представлена моно-сахаридами (глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахаридами (мальтоза, сахароза), также 4-мя другими неидентифицированными углеводами с периодически удерживания 3,08 мин (15,63%), 4,26 мин (7,46%), 7,23 мин (11,72%) и 9,14 мин (7,95%) (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном образчике составляет 21,4% от сух. веса, другими словами выше, чем фруктозы (6,82%), рамнозы (3,47%), арабинозы (3,69%) и мальтозы (11,62%). Их выходы значительно не отличались от контроля на Н2О, кроме сахарозы, которая в дейтерированном образчике не детектируется (табл. 3). Уровни дейтерированности углеводов составили 90,7% D для арабинозы до 80,6% D для глюкозы.
Исследование аминокислотного состава биомассы метилотрофных микробов В. methylicum. Аминокислотный состав гидролизата суммарных белков биомассы В. methylicum, приобретенного в процессе многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде показан в таблице 4. Гидролизат биомассы В. methylicum представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (кроме пролина, который детектировался при 440 нм). Результаты исследования проявили маленькое понижение содержания в дейтерированном белке Ala, Leu и Нis по сопоставлению с белком, приобретенным на обыкновенной воде, что может быть объяснено метаболическим воздействием тяжёлой воды на биосинтез аминокислот (табл. 4).
Таблица 4.
Высококачественный и количественный состав аминокислот гидролизата суммарных белков биомассы В. methylicum и уровни дейтерированности молекул*
Аминокислота
Содержание в белке, % от сухого веса 1 г биомассы
Количество включенных атомов дейтерия
в углеродный скелет молекулы
Уровень дейтерированности, %
Рост на 98% D2O
Рост на Н2О
Gly
9,69
8,03
2
90,0
Ala
13,98
12,95
4
97,5
Val
3,74
3,54
4
50,0
Leu
7,33
8,62
5
49,0
Ile
3,64
4,14
5
49,0
Phe
3,94
3,88
8
95,0
Tyr
1,82
1,56
7
92,8
Ser
4,90
11,68
3
86,6
Thr
5,51
4,81
—
—
Met
2,25
4,94
—
—
Asp
9,59
7,88
2
66,6
Glu
10,38
11,68
4
70,0
Lys
3,98
632
5
58,9
Arg
5,27
4,67
—
—
His
3,72
3,43
—
—
Примечание:* Данные получены для метиловых эфиров N-(диметиламино)нафтален-1-сульфонил хлоридных (дансильных) производных аминокислот. При подсчёте уровня дейтерированности протоны (дейтероны) при СООН- и NH2-группах молекул аминокислот не учитывались из-за лёгкости изотопного (Н-D) обмена. Прочерк значит отсутствие данных.
Исследование ростовых и биосинтетических черт В. subtilis на средах, содержащих тяжёлую воду и гидролизаты дейтеро-биомассы метилотрофных микробов. Графики, отражающие динамику роста, ассимиляции глюкозы и скопление инозина в культуральной воды штаммом В. subtilis в критериях протонированной среды и среды, с 99,9 ат.% D2O представлены на рис. 2. Как видно из рис. 2, при переносе клеток со стандартной на дейтерированную среду выход микробной биомассы, длительность лаг-периода и продолжительность времени клеточной генерации в целом меняются некординально. При росте начального штамма В. subtilis на среде, содержащей обыденную воду уровень скопления инозина в культуральной воды достигал величины 17,3 г/л после 5 суток культивирования (рис. 2).
Рис. 2. Динамики роста B. subtilis (1a, 2a), конверсии глюкозы (1б, 2б) и скопления инозина в культуральной воды (1в, 2в) на средах с разным изотопным составом: 1 а, б, в – мельчайший организм на обыкновенной протонированной БВК-среде; 2 а, б, в – мельчайший организм на очень дейтерированной среде с 2 %-ным гидролизатом дейтеро-биомассы метилотрофных микробов B. methylicum.
Отмечена корреляция в нраве конфигурации ростовых динамик (рис. 2, 1а, 2а), выхода инозина (рис. 2, 1б, 2б) и ассимиляции глюкозы (рис. 2, 1в, 2в). При выращивании приспособленного B. subtilis в очень дейтерированной среде, уровень скопления инозина в культуральной воды понижается по-сравнению с начальным штаммом в протонированной среде. Наибольший выход инозина (17 г/л) зафиксирован в опыте 1б (рис. 2, 1б) на протонированной среде при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 2, 1в). На тяжеловодородной среде выход инозина снижался в 4,4 раза (3,9 г/л) (рис. 2, 2б), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л остаточной неассимилируемой глюкозы в культуральной воды (рис. 2, 2в). Сниженный выход инозина в очень дейтерированной среде находится в корелляции с уровнем конверсии глюкозы, которая в D2O ассимилировалась не стопроцентно, что свидетельствует, что при росте в D2О глюкоза расходуется наименее отлично, чем в контрольных критериях.
Приобретенные для исследуемых микробов данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация клеточки к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, так как приспособленные к тяжёлой воде клеточки ворачиваются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некого лаг-периода. В то же время обратимость роста на D2O/H2O-cpeдax на теоретическом уровне не исключает способности того, что этот признак размеренно сохраняется при росте в тяжёлой воде, но маскируется при переносе клеток на протонированную среду. Можно представить, что клеточка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые содействуют многофункциональной реорганизации работы ферментных систем в тяжёлой воде. Также не исключено, что наблюдаемые при адаптации эффекты связаны с образованием в тяжёлой воде более крепких и размеренных связей, чем связей с ролью водорода. По теории абсолютных скоростей разрыв С-H-связей может происходить резвее, чем C-D-связей, подвижность D3О+ меньше, чем подвижность Н3О+, константа ионизации D2O в 5 раз меньше константы ионизации Н2О (Crespy J., Kalz H.H., 1979). Эти эффекты не могут не отразиться на кинетике хим связи и скорости хим реакций в D2O. При попадании клеточки в тяжёловодородную среду из неё не только лишь удаляется протонированная вода за счет реакции обмена Н2О–D2О, да и происходит резвый H–D обмен в гидроксильных (-ОН), сульфгидрильных (-SH) и аминогруппах (-NH2) всех органических соединений, включая белки, нуклеиновые кислоты, жирные кислоты, углеводы. Понятно, что в этих критериях только ковалентная С–Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С–D могут синтезироваться de novo (Crespi, 1986). С физиологической точки зрения, более чувствительными к подмене протия на дейтерий возможно окажутся аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е. конкретно те клеточные системы, которые употребляют высшую подвижность протонов и высшую скорость разрыва водородных связей.
3. Исследование степеней включения изотопов дейтерия и углерода 13С в молекулы экзогенных аминокислот
B. METHYLICUM и М. FLAGELLATUM.
Получение лиофилизованных образцов культуральных жидкостей, содержащих экзогенные дейтерий- и 13С-аминокислоты. Дейтерий-меченные аминокислоты были выделены в составе препаратов лиофилизованных интактных культуральных жидкостей, свободных от белков и полисахаридов, при росте штамма В. methylicum на малых средах с добавкой 2 об% СНзОН и с разным содержанием тяжёлой воды. 13С-аминокислоты были получены за счет культивирования штамма М. flagellatum на среде, содержащей обыденную воду и 1 об% 13СНзОН. Данные по степеням включения дейтерия и 13С в молекулы экзогенных аминокислот 2-ух исследуемых штаммов приведены в таблице 5. Во всех анализируемых образчиках культуральной воды независимо от рода штаммов способом масс-спектрометрии ЭУ были обнаружены аланин, валин, лейцин/изолейцин и фенилаланин (табл. 5). В масс-спектрах ЭУ дериватизованной культуральной воды M. flagellatum в дополнение к вышеобозначенным аминокислотам также фиксировался глицин.
Получение метиловых эфиров N-дансил- и карбобензокси-производных аминокислот. Степени включения изотопов дейтерия и изотопа углерода 13С в мультикомпонептные консистенции аминокислот в составе культуральной воды и белковых гидролизатов определяли способом масс-спектромстрии ЭУ метиловых эфиров Dns-аминокислот либо в виде Cbz-производных аминокислот после их препаративного разделения способом ОФ ВЭЖХ.
Аналитическое и препаративное разделение Cbz-производных аминокислот проводили ОФ ВЭЖХ, разработанным Егоровой Т. А. (Егорова Т. А., 1993). Степени хроматографической чистоты выделенных из культуральных жидкостей В. methylicum и М. flagellatum Dns-производных дейтерий- и 13С-аминокислот составили 93-95%, а выходы 65-87% соответственно.
Предложенная нами модификация способа синтеза производных аминокислот заключалась в прямой хим обработке препаратов культуральной воды, приобретенной после отделения клеток, DnsCl (и CbzCl) и CN2H2. Реакцию проводили в щелочной среде в присутствии 4 н. NaOH в водно-органическом растворителе (ацетон) в соотношении DnsCl/CbzCl-аминокислота, равным 5:1 (см. схему ниже).
Схема. Реакция синтеза DNs- и Cbz-производных аминокислот.
Для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина вместе с моно-производными было типично образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Cbz-(Dns)-лизина, ди-Cbz-(Dns)-гистидина, О,N-ди-Cbz-(Dns)-тирозина, О,N-ди-Cbz-(Dns)-серииа, O,N-Cbz-(Dns)-тpeoнина и N,S-ди-Cbz-(Dns)-цистеина. Не считая этого, из аргинина синтезировался три-Cbz-(Dns)-аргинин.
Летучесть Dns- и Cbz-производных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе увеличивали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана в качестве этерифицирующего реагента был связан с необходимостью проведения реакции в мягеньких критериях, исключающих оборотный изотопный (H-D)-обмен в ароматических аминокислотах. При использовании диазометана происходило дополнительное N-метилирование по a-NH2 гpynne аминокислот, в итоге чего в масс-спектрах метиловых производных аминокислот фиксировались дополнительные пики, надлежащие соединениям с молекулярной массой на 14 масс. ед. больше начальных.
Исследование степеней включения дейтерия в молекулу L-фенилаланина В. methylicum, приобретенного со сред с тяжёлой водой. Как видно из данных табл. 2, рост данного штамма метилотрофных микробов на средах с вырастающими концентрациями тяжёлой воды сопровождался понижением уровней скопления клеточной биомассы, повышением времени генерации микробов и длительности лаг-периода при сохранении возможности синтезировать и копить L-Phe в ростовой среде. Потому было любопытно изучить, как меняются степени включения дейтерия в молекулу L-Phe и других аминокислот В. methylicum в этих критериях.
Во всех опытах наблюдалось специфическое возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при ступенчатом увеличении концентраций тяжёлой воды в ростовой среде (табл. 5). Так, для личных аминокислот культуральной воды В. melhylicum, количество включённых атомов дейтерия по скелету молекул варьирует в границах 49%-ной концентрации D2O и составляет для Phe – 27,5%, Ala – 37,5%, Val – 46,3%, Leu/Ile – 47% (табл. 5). Аналогичное повышение молекулярной массы аминокислот зависимо от концентрации тяжёлой воды в среде было зафиксировано во всех изотопных опытах.
Таблица 5.
Степени включения (ат.%) дейтерия и изотопа углерода 13С в молекулы секретируемых аминокислот В. melhylicum и M. flagellation*.
Аминокислоты
Содержание D2О в среде, %
13СН3ОН
24,5
49,0
73,5
98,0
1
Gly
—
—
—
—
60,0
Ala
24,0
37,5
62,5
77,5
35,0
Val
20,0
46,3
43,8
58,8
50,0
Leu/Ile
15,0
47,0
46,0
51,0
38,0
Phe
15,0
27,5
51,3
75,0
95,0
Примечание: * Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. methyticum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O. Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О.
Исследование степеней включения дейтерия в сопутствующие аминокислоты В. methylicum на средах с тяжёлой водой. В масс-спектрах ЭУ всех исследуемых образцов культуральной воды B. melhylicum не считая основной секретируемой аминокислоты (фенилаланин) были обнаружены примеси, метаболически с ней связанных аланина, валина и лейцина/изолейцина (на уровне 3–5 мМ). В опыте, где концентрация тяжёлой воды в среде составила 49 об.% (таблица 5, опыт 5), изотопный состав фенилаланина характеризовался повышением молекулярной массы на 4,1 единицу, аланина на 2,5 единицы, валина – 3,5 единицы, а лейцина/изолейцина – на 4,6 единиц. Таким макаром, в отличие от фенилаланина, количество включенного дейтерия в последних 3-х аминокислотах сохраняет размеренное всепостоянство в достаточно широком интервале концентраций тяжёлой воды (от 49 об.% до 98 об.%).
В связи с тем, что штамм – продуцент фенилаланина В. methylicum был ауксотрофом по лейцину, эту аминокислоту в немеченном виде добавляли в ростовую среду, содержащую 98 об.% D2О. Как проявили наши исследования по включению дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот, в критериях ауксотрофности по лейцину степень изотопного обогащения лейцина, также метаболически связанных с ним аминокислот малость ниже, чем для других аминокислот. Так, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% D2O и немеченный L-Leu, степени включения дейтерия в молекулу Leu составили 51,0%, Ala –77,5%, Val – 58,8% (табл. 5). Суммируя приобретенные данные, можно прийти к выводу о сохранении минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом лейцина de novo. Другим разъяснением наблюдаемого эффекта может быть ассимиляция клеточкой не меченного лейцина из среды на фоне биосинтеза меченного изолейцина de novo.
Исследование степеней включения дейтерия в L-Phe В. methylicum в очень дейтерированной среде. Мы представили, что за счёт ауксотрофности штамма В. methylicum по лейцину, уровни включения дейтерия в секретируемыи фенилаланин на фоне наибольших концентраций тяжёлой воды могут быть ниже на теоретическом уровне допустимых вследствие функционирования в клеточке ряда биохимических реакций, связанных с ассимиляцией протонированного лейцина снаружи. Как и ожидалось, отмеченная особенность идеальнее всего проявлялась при биосинтезе фенилаланина на дейтерированной среде, в какой единственным протонированным соединением, не считая метанола, являлся лейцин (см. табл. 5, опыт 9). В этом опыте степень дейтерированности фенилаланина составила 75%, т.е. только 6 атомов (из восьми в углеродном скелете) в молекуле фенилаланина биосинтетически замещены на дейтерий. Согласно данным масс-спектрометрического анализа, атомы дейтерия распределены по положениям С1–С6ароматичной части фенилаланина и сопредельному положению b, при этом, как миниум четыре из их могут быть локализованы в самом в бензильном С6Н5СН2-фрагменте молекулы фенилаланина. Из масс-спектрометрических данных следует, что при других концентрациях D2О дейтерий также врубается в ароматичное кольцо фенилаланина, потому что метаболизм приспособленного к D2О штамма B. methylicum не претерпевает существенных конфигураций в D2О. Итог по получению фенилаланина с данным нравом включения метки важен для биотехнологического использования и имеет значительные достоинства по сопоставлению с хим (Н–D)-обменом (Griffiths D. V., 1986).
Исследование степени включения дейтерия в молекулу фенилаланина за счёт конверсии дейтерометанола CD3OD в В. methylicum. Контроль за включением дейтерия в молекулу L-Phe за счет конверсии CD3OD при росте микробов на среде, содержащей обыденную воду и 2 об.% CD3OD (соответствуют опыту 2, табл. 1) показал малозначительное количество дейтерия, которое поступает в молекулу L-фенилаланина совместно с углеродом CD3OD; уровень дейтерированнности молекулы фенилаланина был вычислен по величине пика с m/z 413 за вычетом вклада пика примеси природного изотопа (менее 4%). Приобретенный итог может быть объяснён разбавлением дейтериевой метки за счёт протекания как биохимических процессов, связанных с распадом CD3OD при его ассимиляции клеточкой, так и реакциями изотопного обмена и диссоциации в тяжёлой воде. Так, из четырёх атомов дейтерия, имеющихся в молекуле СD3OD, только один атом дейтерия при гидроксидной группе самый подвижный и потому просто диссоциирует в аква среде с образованием СD3ОН. Три оставшихся атома дейтерия в составе СD3ОН входят в цикл ферментативного окисления метанола, который, в свою очередь, мог привести к потере дейтериевой метки за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. А именно, такое включение дейтерия в молекулу L-фенилаланина подтверждает традиционную схему ферментативного окисления метанола до метаналя в клеточках метилотрофов, который только после чего ассимилируется у данного штамма метилотрофных микробов РМФ-путем фиксации углерода (Nesvera J., 1991).
Исследование степеней включения изотопа углерода 13С в молекулы экзогенных аминокислот М. flagellatum за счёт биоконверсии 13СН3ОН. Наши исследования подтвердили, что для получения 13С-аминокислот за счет микробной конверсии 13СН3ОН подготовительная адаптация не является лимитирующим шагом, так как этот субстрат не оказывает негативного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические свойства метилотрофов. При росте М. flagellatum на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О клеточка продуцирует лейцин, a также глицин, аланин, валин и фенилаланин. Как видно из таблицы 5, уровни изотопного включения 13С в молекулы Gly, Ala, Val и Phe составляют 60%, 35%, 50% и 95% ат. дейтерия соответственно. При всем этом низкая степень включения изотопа углерода 13С в метаболически связанные с изолейцином аминокислоты обоснована эффектом ауксотрофиости микробов в изолейцине, который добавляли в ростовую среду в немеченном виде.
4. Исследование степеней включения изотопов дейтерия и углерода 13С в аминокислотные остатки суммарных белков
B. METHYLICUM и М. FLAGELLATUM.
Выделение дейтерий- и 13С-аминокислот из белковых гидролизатов. Так как при работе с микробной биомассой появляются трудности, связанные с чисткой от сопутствующих компонент, было нужно использовать особые подходы при выделении фракции суммарных белков из бактериальных источников.
При выделении фракции суммарных белков биомассы метилотрофных микробов (В. methylicum, M. flagellatum) учитывалось наличие в их углеводов. Мы использовали богатые по белку штаммы микробов со сравнимо маленьким содержанием углеводов в их, гидролизу в качестве фракции суммарных белков подвергали остаток после исчерпающего отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями (метанол–хлороформ–ацетон).
Во всех случаях гидролиз белков проводили в 6 н. растворе DCl (3% оксибензола в D2O) либо в 4 н. растворе Ва(ОН)2 для предотвращения реакций оборотного изотопного обмена (H–D) в ароматичных аминокислотах и их разрушения.
Дейтерий- и 13С-меченные аминокислоты в составе гидролизатов суммарного белка биомассы были разбиты способом ОФ ВЭЖХ со степенью хроматографической чистоты 93–96% и выходами 75–89% в критериях, подобных таким для разделения секретируемых аминокислот (табл. 6). Эти данные доказаны данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных микробов способом ионнообменной хроматографии на колонке Biotronic LC 5001.
Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы В. methylicum на средах с тяжёлой водой. Общие принципы исследования степени изотопного обогащения молекул аминокислот при данном методе введения метки продемонстрированы на примере анализа включения дейтерия в мультикомпонентные консистенции аминокислот, приобретенные после гидролиза суммарных белков биомассы в 6 н. DCl и 4 н. Ва(ОН)2.
Таблица 6.
Степени включения (ат.%) дейтерия и изотопа углерода 13С в аминокислотные остатки общих белков биомассы В. melhyiicum и М. flagellatum.
Аминокислоты
Содержание D2O в среде, об.%
13СН3ОН
24,5
49,5
73,5
98,0
1
Gly
15,0
35,0
50,0
90,0
90,0
Ala
20,0
45,0
62,5
97,5
95,0
Val
15,0
36,3
50,0
50,0
50,0
Leu/Ile
10,0
42,0
45,0
49,0
49,0
Phe
24,5
37,5
50,0
95,0
80,5
Туr
20,0
48,8
68,8
92,8
53,5
Ser
15,0
36,7
47,6
86,6
73,3
Asp
20,0
36,7
60,0
66,6
33,3
Glu
20,0
40,0
53,4
70,0
40,0
Lys
10,0
21,1
40,0
58,9
54,4
Примечание: *Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. methylicum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O. Данные по включению 13С приведены для М. flagellatum при росте на среде, содержащей 1 об.% 13СН3ОН и 99 об.% Н2О.
Во всех опытах по исследованию содержания дейтерия в аминокислотных остатках белка наблюдалась корреляция меж степенью изотопного насыщения среды и уровнями включения дейтерия в аминокислоты (табл. 6), К примеру, для личных аминокислот белковых гидролизатов количество включенных атомов дейтерия по скелету молекулы варьирует некординально в границах 49%-ной D2O и составляет для Ala — 45%, Val – 36,3%, Leu/Ile – 42%, Phe – 37,5%.
Исследование степеней включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарных белков В. melhylicum на очень дейтерированной среде. Приобретенные данные свидетельствуют о способности заслуги наибольших уровней включения дейтерия в аминокислотные остатки белков за счет адаптации культуры В. melhyiicum к росту и биосинтезу на среде М9 с наибольшей концентрацией тяжёлой воды. Как видно из таблицы 6, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% D2O, степени включения дейтерия в остатки Gly, Ala и Phe составляют 90%, 97,5% и 95% ат. дейтерия, т.е. уровень мечения можно считать униформным. Низкие степени включения дейтерия в молекулы лейцина (49%), также в метаболически связанных аминокислотах в этих критериях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированной форме. Приобретенный итог по разбавлению дейтериевой метки в лейцине может быть объяснён сохранением толики минорных реакций в биосинтезе лейцина de novo.
Исследование степеней включения изотопа углерода 13C в аминокислотные остатки суммарных белков М. flagellatum за счёт биоконверсии 13СH3ОН. В опытах по включению изотопа углерода 13С в молекулы суммарных белков за счёт биоконверсии 13СH3ОН метилотрофными микробами М. flagellalum была показана эффективность мечения аминокислот изотопом углерода 13С. Так, в молекуле Phe детектировалось 80,5% дейтериевой метки, в Ala – 95%, в Gly – 90% (см. табл. 6).
Во всех опытах степени включения дейтерия и изотопа углерода 13С в молекулы метаболически связанных аминокислотах нашли определённую коррелляцию. Так, степени изотопного обогащения аланина, валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматичных аминокислот, синтезируемых из шикимовой кислоты) совпадают (табл. 6). Степени изотопного включения глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Сравнивая данные таблицы 5 и 6, можно заключить, что степени изотопного обогащения экзогенных аминокислот и соответственных аминокислотных остатков суммарного белка, в целом, также коррелируют.
Как и в случае с экзогенными аминокислотами, низкие степени включения изотопа углерода 13С в остатки Leu при росте на 1 об.% 13СНзОН обоснованы ауксотрофностью микробов в этой аминокислоте.
Таким макаром, нам удалось достигнуть наибольших уровней включения размеренных изотопов в суммарные белки биомассы метилотрофных микробов. Потому мы посчитали вероятным использовать гидролизаты их дейтеро-биомассы для биосинтеза других изотопно-меченных БАС в следующих опытах.
5. Исследование способности использования гидролизатов биомассы метилотрофных микробов В. METHYLICUM в качестве субстратов для получения [1′,3′,4′,2,8-D5]-инозина.
Получение [1′,3′,4′,2,8-D5]-инозина. В последующих опытах было апробировано внедрение дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных микробов B. methylicum, приобретенных на прошлом шаге работы в критериях многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для синтеза высокодейтерированных нуклеозидов (на примере инозина).
Для биосинтеза дейтерий-меченого инозина использовали штамм грамположительных микробов B. subtilis (за ранее приспособленный к дейтерию скринингом до отдельных колоний), который из-за нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых рибонуклеозидов синтезирует в стандартных критериях выкармливания (БВК-среда, поздний экспоненциальный рост, 32-34 0С) 17 г инозина на 1 л культуральной воды. Наибольший выход инозина достигался при использовании природной протонированной среды, содержащей в качестве источников ростовых причин и аминного азота 2% БВК дрожжей, а в качестве источника углерода и энергии глюкозу (более 12 мас.%).
Выделение инозина заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом при -4 0С, адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстрактивного извлечения рибонуклеозидов этанольно-аммиачным веществом при 60 0С, а инозина – экстракцией 0,3 М NH4-формиатным буфером (рН 8,9), с следующей перекристаллизацией в 80% этаноле и ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0,3 М NH4-формиатным буфером с 0,045 М NH4Cl с ТСХ контролем при Rf = 0,5. Степень хроматографической чистоты инозина составила 92%.
Плюсы разработанного способа получения дейтерий-меченного инозина заключаются в последующих качествах:
- в возможности высокоактивного штамма В. subtilis к росту и биосинтезу инозина на средах, содержащих наибольшие концентрации тяжёлой воды;
- подмене глюкозы и аминокислот, нужных для роста этого штамма-ауксотрофа на гидролизаты дейтеро-биомассы В. methylicum. При следующих ферментациях в качестве источника ростовых причин можно использовать ту же дсйтеро-биомассу метилотрофных микробов, или биомассу самого штамма-продуцента, содержащую в собственном составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых причин;
- в фактически полном отсутствии отходов: согласно схеме, дейтеро-биомасса базисного штамма, после гидролиза в 6 н. DCl ворачивается в цикл в качестве ростовых причин;
- в высочайшей степени изотопного обогащения дейтерий-меченного инозина (62,5% атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий);
- в больших выходах (3,9 г/л) дейтерий-меченного инозина.
Исследование уровня дейтерированности инозина. Уровень дейтерированности инозина изучили способом масс-спектрометрии FAB из-за высочайшей чувствительности, позволяющей детектировать 10-8–10-10 моль вещества в пробе. При анализе степени дейтерированности инозина учитывались последующие нюансы. Во-1-х, вследствие того, что протоны в C1–C’5 положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, мы представили,что нрав биосинтетического включения дейтерия в рибозную часть молекулы инозина определяется, в главном, функционированием ряда процессов гексозо-6-моно-фосфатного (ГМФ) шунта, связанных конкретно с ассимиляцией глюкозы и других сахаров. Во-2-х, бессчетные обменные процессы и внутримолекулярные перегруппировки, происходящие с ролью тяжёлой воды, могли также привести к специфичному включению метки по определенным позициям в молекуле инозина. Такими доступными позициями в молекуле инозина признаны, сначала, гидроксильные протоны и протоны при гетероатомах -NH (последние могут обмениваться на дейтерий в тяжёлой воде за счет кето-енольной таутомерии). Три атома дейтерия в рибозном остатке молекулы инозина могли происходить за счет функционирования бессчетных реакций ГМФ-шунта, два атома дейтерия а остатке гипоксантина также могли синтезироваться de novo.
6. Разработка методов биосинтетического получения дейтерий-меченhoго бактериородопсина
Получение дейтерий-меченного бактериородопсина. В качестве другой модельной системы для введения размеренной изотопной метки в белки, использовали ретинальсодержащий белок бактериородопсин (БР), выполняющий роль АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране солелюбивой галобактерии H. halobium ET 1001. БР – фотопреобразующий белок с молекулярным весом 26,7 кДа представляет собой хромопротеид, связанный альдиминной связью с остатком лизина-216, который содержит в качестве хромоформной группы эквимолекулярную смесь 13-цис- и стопроцентно 13-транс-ретиналя, определяющего пурпурно-красный цвет галобактерий. Полипептидная цепь БР состоит из 248 аминокислотных остатков, 67% которых являются гидрофобными и ароматичными, а 33% – гидрофильными остатками из аспарагиновой и глутаминовой кислотами, аргинином и лизином. Эти остатки играют важную структурно-функциональную роль в пространственной ориентации ?-спиральных участков молекулы БР. Молекулы БР организованы в клеточной мембране в виде тримеров; каждый тример окружен шестью другими так, что появляется верная гексагональная решетка. Молекула БР состоит из 7 находящихся в конформации ?-спирали частей, пронизывающих всю толщу мембраны клеточки в направлении, перпендикулярном ее плоскости (рис. 3). Гидрофобные домены представляют собой трансмембранные сегменты, а гидрофильные домены выступают из мембраны и соединяют отдельные внутримембранные ?-спиральные участки белковой молекулы БР.
Рис. 3. Размещение белковой части молекулы БР и остатка ретиналя в клеточной мембране галобактерии H. halobium по данным компьютерного моделирования: белковые куски молекулы БР в виде 7 пронизывающих клеточную мембрану a-спиральных частей обозначены латинскими знаками; темным цветом обозначены сегменты, ответственные за связывание остатка ретиналя в молекуле БР с белковой частью молекулы.
Выбор метода выделения БР был определен целью исследования, связанной с исследованием принципной способности получения дейтерий-меченных препаратов БР в препаративных количествах. Для включения дейтериевой метки в молекулу БР использовали два принципно хороших подхода: сайт-специфическое введение отдельных аминокислот: L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp в БР и униформное мечение БР дейтерием методом выкармливания H. halobium ET 1001 на среде, содержащей 99,9 ат.% D2O и 2% гидролизат дейтеро-биомассы В. methylicum. При выборе L-[2,3,4,5,6-D5]-фенилаланина, L-[3,5-D2]-тирозина и L-[2,4,5,6,7-D5]-триптофана в качестве источников изотопных меток, учитывалась значимость этих аминокислот в функционировании БР, стабильность дейтерий-меченных аналогов этих аминокислот к (H–D) обмену в аква среде в критериях культивирования, также возможность их детектирования способами масс-спектрометрии.
Основными шагами получения дейтерированных препаратов БР являлись: выкармливание галобактерий H. halobium на синтетических средах тяжеленной водой и [2, 3, 4, 5, 6-D5]-фенилаланином (0,26 г/л), [3, 5-D2]-тирозином (0,2 г/л) и [2, 4, 5, 6, 7-D5]-триптофаном (0,5 г/л), выделение фракции пурпуровых мембран (ПМ), отделение от низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, промывка 50% этанолом при –4 0С, фракционирование солюбилизированного в 0,5% ДДС-Na белка метанолом, гель-проникающая хроматография на сефадексе G-200, электрофорез в 12,5% ПААГ с 0,1% ДДС-Na.
В хороших критериях выкармливания галобактерий H. halobium, в клеточке синтезировался каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы D280/D568= 1,5 : 1 стопроцентно схожий природному БР (рис. 4). Как проявили результаты исследования, рост галобактерий на всеохватывающей синтетической среде (рис. 7, б) ингибировался некординально по сопоставлению с контролем (рис. 4, а) на пептоновой среде, что значительно упрощает и удешевляет оптимизацию критерий биосинтеза БР, который заключается в культивировании галобактерий в синтетической среде TS при освещении монохромным светом с ? = 560 нм в течение 4–5 сут при 35 0С.
Рис. 4. Динамика роста галобактерии H. halobium в разных экспериментальных критериях: пептоновая среда (а), всеохватывающая синтетическая среда (б). Условия выкармливания: период инкубации 4–5 сут при 35 0С, освещение монохромным светом с длиной волны ? = 560 нм.
Выделяемый белок локализуется в ПМ; разрушение мембран и освобождение от низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим шоком клеток дист. водой на холоде после удаления 4,3 М NaCl и следующим разрушением клеточной оболочки ультразвуком при 22 кГц. Потом проводили обработку клеточного гомогената РНК-азой I (2–3 ед. акт.).
Оба подхода проявили отличные результаты по введению дейтериевой метки в молекулу БР. Так, в масс-спектре ЭУ гидролизата БР, приобретенного с селективной среды, содержащей L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp, после обработки обскурантистской консистенции Dns-Cl и CN2Н2фиксируются пики, надлежащие молекулярным ионам обогащённых дейтерием Dns-Phe-OMe с М+ при m/z 417 (заместо m/z 412 в контроле), Dns-Tyr-OMe с М+ при m/z 429 (заместо m/z 428) и Dns-Trp-OMe с М+ при m/z 456 (заместо m/z 451). В случае с униформным мечением БР, метка врубалась умеренно по всем положениям углеродного скелета в аминокислотных остатках белка. ОФ ВЭЖХ метиловых эфиров Dns-, и Cbz- аминокислот, приобретенных после гидролиза БР в 4 н. Ва(ОН)2 либо 6 н. DCl (3 масс.% оксибензола, в D2O) показала высочайшие степени хроматографической чистоты выделенных производных аминокислот. Согласно данным, степени хроматографической чистоты выделенных дейтерий-меченных L-[2,3,4,5,6-D5]-Phe, L-[3,5-D2]-Tyr и L-[2,4,5,6,7-D5]-Trp составили 96%, 97% и 98% соответственно.
Выводы:
- Подобраны условия для проведения адаптации штаммов B. melhylicum, H. halobium, В. subiilis и B. amyloliquefaciens к росту на D2О-средах. Селекционно отобраны колонии клеток, сохранившие высочайшие ростовые и биосинтетические свойства на средах с наивысшими концентрациями тяжёлой воды.
- Показана принципная возможность использования суммы хим компонент дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных микробов В. methylicum в качестве источников ростовых субстратов для синтеза высокодейтерированных БАС.
- Исследовано воздействие меченных субстратов – D2O, CD3OD и 13СН3ОН на ростовые и биосинтетические характеристики разных штаммов-продуцентов аминокислот, белков и нуклеозидов. Показано, что униформные уровни включения дейтерия в молекулы синтезируемых БАС можно получить, используя высокодейтерированные среды (D2О и СD3D), а в случае с 13С-мечением такого же результата можно добиться за счёт использования 13СНзОН.
- Предложена дансильная модификация образцов культуральной воды для исследования степеней изотопного обогащения аминокислот способом масс-спектрометрии электрического удара. Способ позволяет проводить анализ изотопного состава мультикомпонентных консистенций аминокислот, как свободных аминокислот из культуральной воды, так и аминокислот в составе гидролизатов суммарных белков биомассы.
- Проведено сравнительное исследование степеней включения дейтерия и изотопа углерода 13С в молекулы секретируемых аминокислот, так и в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы метилотрофных микробов в критериях их роста на средах, содержащих ступенчато увеличивающие концентрации тяжёлой воды.
- Определена корреляция меж уровнем включения изотопной метки в молекулы аминокислот и концентрации тяжёлой воды в ростовых средах.
- Разработана схема получения дейтерий-меченных БАС с высочайшими степенями изотопного обогащения, основанная на использовании етеротрофных микробов — продуцентов соответственных БАС. Данная схема испытана на примере получения дейтерий-меченных инозина и бактериородопсина.
- Изучены способы селективного и униформного введения дейтериевой метки в бактериородопсин. Показано, что включение отдельных дейтерий-меченных аминокислот в молекулу бактериородопсина носит селективный нрав, а внедрение приспособленного к D2O Н. halobium ET 1001 на средах с меченными субстратами и 99,9% D2O позволяет получать униформно меченный бактериородопсин.
Перечень публикаций по теме диссертационной работы.
- Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. Биосинтетическое получение дсйтерий-мсченного L-фенилалаиина, секрстируемого метилотрофным мутантом Brevibaclerium methylicum // Биотехнология. 1993. №9. С. 16-20,
- Егорова Т. А., Мосин О. В., Еремин С. В., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Препаративное разделение аминокислот белковых гидролизатов в виде бензилоксикарбонильных производных // Биотехнология. 1993. № 8. С. 21-25.
- Беккер Г. Д., Мосин О. В., Карнаухова Е. Н. Аминокислоты, меченные размеренными изотопами: получение и масс-спектро метрически и контроль. (Тезисы докл. 4-й Всероссийской научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии»)- Екатеринбург. 20-22 апрель 1994. С. 127-128.
- Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Складнев Д. А., Акимова О. Л., Цыганков Д, Ю. Штамм Brevibacterium methylicum — продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.
- Казаринова Л. А., Королькова Н. В., Миронов А. С., Мосин О. В.. Складнев Д. А., Юркевич А. М. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.
- Karnaukhova Е. N., Mosin О. V., Reshetova О. S. Biosynthetic production of stable isotope labeled ammo acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum // Ammo Acids. 1993. V. 5. № 1. P. 125.
- Mogin O. V., Karnaukhova E. N., Pshenichnikova А. В., Reshetova O. S. Electron impact spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin. 6th International Conference on Retinal Proteins. 19-24 June 1994. Leiden. The Netherlands. P. 115.
- Mosin O. V,. Karnaukhova E. N., Skladnev D. A. Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labeled amino acids. 7thInternational Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms. 26 June 1994. Quebec. Canada. P. 163.
- Matveev A. V., Mosin_O.V., Skladnev D. A., Yurkevich A. M., and Shvcts V. Melhylolrophic adaptation to highly deuterated substrates. 8th International Symposium on Microbial Growth on Ci-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 49.
- Mosin O. V., Karnaukhova E. N., Skladnev D. A., and Shvets V. I. Preparation of D-and 13C-amino acids via bioconvertion of Ci-substrates, 8lh International Symposium on Microbial Growth on Сi-Compounds. 27 August-l September 1995. San Diego. U.S.A. P. 80.
- Shvets V. I., Yurkevich A. M., Mosin_O. V., Skladnev D. A. Preparation of deuterated inosine suitable for biornedical application // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V. 8. № 4. P. 231-232.
- Мосин О. В., Складнее Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих томную воду. II Биотехнология. № 3. 1996. С. 3-12.
- Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Получение бантериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана // Биотехнология. № 4. 1996. С. 27-35.
- Мосин _О.В., Казаринова Л. А., Преображенская Е. С., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. // Биотехнология. № 4. 1996. С. 19-27.