Биосинтез аминокислот штаммом Вrevibacterium methylicum
Биосинтез аминокислот штаммом Вrevibacterium methylicum Исследование БИОСИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ ШТАММОМ Вrevibacterium methylicum ПРИ РОСТЕ НА СРЕДАХ, СОДЕРЖАЩИХ Томную ВОДУ И ДЕЙТЕРО-МЕТАНОЛ
О. В. МОСИН
Столичная муниципальная академия узкой хим технологии им. М.В. Ломоносова, г. Москва, просп. Вернадского, д.86.
Способ мечения размеренными изотопами является главным направлением в разнопрофильных биохимических исследовательских работах с внедрением аминокислот и других на биологическом уровне активных соединений (БАС) [1,2]. Тенденции к желательному применению размеренных изотопов, а именно, дейтерия по-сравнению с радиоактивными аналогами обоснованы такими их преимуществами, как отсутствием радиационной угрозы и возможностью определения локализации метки в молекуле прямыми способами. Насыщенное развитие изотопно-чувствительной техники, сначала спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопии и масс-спектрометрии (МС), за последние годы позволило существенно усовершенствовать проведение бессчетных био исследовательских работ de novo, также учить структуру и механизм деяния клеточных БАС на молекулярном уровне [3,4].
Начиная с первых тестов Катца с соавт. [5] по культивированию микроводорослей Chlorella на тяжеленной воде длятся разработки методических подходов по получению БАС, в том числе аминокислот, меченных дейтерием. Потребности в дейтерированных аминокислотах обоснованы их принципиальной ролью в различных биохимических и мед исследовательских работах, также возможностью их использования в синтезах широкого круга дейтерированных БАС, к примеру, в синтезах пептидных гормонов и нейротрансмиттеров с внедрением L-фенилаланина [6-8].
В текущее время биотехнологический потенциал метилотрофных микробов для получения аминокислот, меченных размеренными изотопами, а именно, дейтерием, общепризнан [9]. Современные способы мутагенеза и селекции открывают широкие перспективы для получения новых С1 -утилизирующих штаммов-продуцентов аминокислот, применимых для роста на D2O. В связи с этим, большой практический энтузиазм представляет исследования процессов биосинтеза аминокислот на генном уровне маркированными штаммами метилотрофных микробов, которые устойчивы к высочайшим концентрациям дейтерия в ростовых средах.
Преждевременное нами была исследована возможность использования штамма факультативных метилотрофных микробов B. methylicum для получения дейтерированного фенилаланина [10]. В отличие от обычных штаммов-продуцентов фенилаланина, у каких нарушены активности префенатдегидратазы либо дезоксиарабиногептулозофосфатсинтетазы, уникальность этого штамма заключается в том, что для биосинтеза L-фенилаланина нужен L-лейцин.
Целью истинной работы было исследование уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот штамма B. methylicum как секретируемых в культуральную жидкость, так и аминокислот в составе белковых гидролизатов биомассы этих микробов на средах с разным содержанием СН3ОН/CD3OD и D2O в их.
УСЛОВИЯ Опыта
Бактериальные штаммы. Исследования проводили с L-лейцин-зависимым штаммом факультативных метилотрофных микробов B. methylicum, продуцентом L-фенилаланина. Штамм был получен из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микробов (ВКПМ) Муниципального научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микробов.
Для изготовления питательных сред с разным содержанием дейтерия в их (см. табл.1) использовали безводные соли квалификации “х.ч.”, D2O (99,9% D) и СD3ОD (97,5 %D), приобретенные из Русского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). По необходимости томную воду очищали от вредных примесей, перегоняя ее над перманганатом калия. Для получения производных аминокислот использовали N-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид (дансилхлорид) (Sigma, CША) и диазометан. Диазометан получали из N-нитрозометилмочевины (Мerck, Германия).
Культивирование штамма В. methylicum проводили на малых средах М9 [11] как описано в работе [10].
Экстракцию липидов проводили консистенцией хлороформ-метанол (2:1) по способу Блайя и Дайера [12].
Щелочной гидролиз белка. Белок (4-5 мг) гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 5 мл 4 н. Ba(OH)2 в течение 24 ч при 110 0С. Гидролизаты суспендировали в 20 мл жаркой дист. воды и нейтрализовали 2 н. веществом H2SO4 с следующим отделением осадка центрифугированием (10 000 об/мин, 5 мин). Гидролизаты упаривали в роторном испарителе при 400 С.
Получение дансиламинокислот культуральной воды. К 200 мг лиофилизованных препаратов культуральной воды в 5 мл 2 м. NaHCO3 (2 10-3 моль) рН 9-10 дробными порциями при смешивании добавляли 320 мг (1,2 10-3 моль) дансилхлорида в 5 мл ацетона. Обскурантистскую смесь выдерживали при смешивании при 400 С в течении часа, потом подкисляли 2 м. веществом HCL до рН 3,0 и экстрагировали этилацетатом (3 раза по 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН 7,0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.
Дансиламинокислоты в составе белковых гидролизатов B. methylicum получали как описано в работе [9].
Получение метиловых эфиров дансиламинокислот. К 20 мл 40 %-ного КОН в 40 мл эфира добавляли 3 г увлажненной нитрозометилмочевины и размешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После насыщенного газовыделения эфирный слой отделяли и промывали ледяной водой до рН 7,0, сушили безводным NaSO4 и обрабатывали им препараты дансилпроизводных аминокислот в составе культуральной воды и гидролизатов белка биомассы.
Количественное определение L-фенилаланина в культуральной воды проводили на спектрофотометре“Beckman DU-6” (США) при 540 нм после обработки препаратов культуральной воды нингидрином, как обозначено в работе [10].
Масс-спектры электрического удара производных аминокислот получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение дейтерий-меченных аминокислот и их масс-спектрометрический анализ.
Данные по росту штамма B. methylicum и наибольшему уровню скопления фенилаланина в культуральной воды на средах с 2 об.% СН3ОН (СD3OD), содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации D2O представлены в таблице 1. Как видно из данных таблицы, рост исследуемых микробов на средах с вырастающими концентрациями тяжеленной воды сопровождался конфигурацией выходов биомассы, времени клеточной генерации и длительности лаг-фазы при сохранении возможности синтезировать и копить фенилаланин в культуральной воды. Потому было нужно изучить, как меняются степени включения дейтерия в фенилаланин и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы B. methylicum в этих критериях.
ТАБЛИЦА 1.
Воздействие изотопного состава среды на рост штамма B. methylicum и уровень скопления L-фенилаланина в культуральной воды.
Для определения степени включения дейтерия в аминокислоты способом масс-спектрометрии электрического удара использовали метиловые эфиры дансил-аминокислот, которые химически размеренны и дают насыщенные пики молекулярных ионов в масс диапазонах [13]. В качестве примера на рис.1 показана фрагментация метилового эфира дансилфенилаланина при электрическом ударе. В масс-спектрах этого производного, обычно, верно детектируется пик молекулярного иона метилового эфира дансилфенилаланина М+. с m/z 412. Пик аминного куска А имеет невысокую интенсивность, а пик аминоацильного куска В очень низкую либо вообщем отсутствует (см. рис. 1). Интенсивности пиков аминных А и аминоацильных В фрагментов других производных аминокислот, к примеру присутствующих в культуральной воды аланина, валина и лейцина (изолейцина) при электрическом ударе также сравнимы.
Не считая вышеобозначенных пиков, в масс-спектрах электрического удара метиловых эфиров дансил-аминокислот фиксируются пики с m/z 250, 234, 170, которые соответствуют дансильному куску и продуктам его распада до N-диметиламинонафталина .
Модификация способа получения метиловых эфиров дансил-аминокислот заключалась в прямой обработке препаратов культуральной воды, приобретенной после отделения клеток, дансилхлоридом и диазометаном. В итоге внедрения этого подхода удалось получить чётко интерпретируемые масс-спектры электрического удара метиловых эфиров дансил-аминокислот в присутствии следовых количеств низкомолекулярных метаболитов среды и сопутствующих аминокислот не прибегая к их подготовительному хроматографического разделению и чистке. Необходимо подчеркнуть, что в критериях проведения дансильной дериватизации, для основной аминокислоты лизина типично образование ди-дансильных производных, а для тирозина также происходит дополнительное дансилирование по гидроксильной -ОН-группе. При этерификации аминокислот диазометаном не исключено дополнительное N-метилирование по а-NH2-группе аминокислот, что приводит к возникновению в масс-спектре метиловых эфиров дансил-аминокислот пиков, соответственных соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше начальных [14]. В качестве примера на рис. 2,б приведен масс-спектр секретируемого фенилаланина и сопутствующих аминокислот в составе дериватизированной культуральной воды в критериях опыта 5 (см. табл.1, опыт 5), где концентрация D2О в среде добивается 49 об.% (диапазон приведен относительно контрольных критерий (а), где использовали обыденную воду и метанол). Из рис.2,б видно, что в этих критериях величина пика молекулярного иона производного фенилаланина (М+. с m/z 414,2) возрастает по сопоставлению с контрольными критериями (М+. с m/z 412,0) на 2,2 единицы, что составляет 27,5 % от полного количества атомов водорода в молекуле. Пик с m/z 400, зафиксированный в масс-спектре культуральной воды (рис.2,б) скорее всего соответствует продукту отщепления метильной группы -СН3 от дейтерированного производного фенилаланина.
Масс-спектр культуральной воды, приобретенной на среде, содержащей 73,5 об.% D2О и 2 об. % СН3ОН после обработки дансилхлоридом и диазометаном представлен на рис. 3,а. Присутствие в масс-спектре этого эталона пика молекулярного иона метилового эфира дансил-фенилаланина с М+. с m/z 416,1 (заместо 412 в контроле) показывает на повышение массы фенилаланина на 4,1 единицу, т.е., 51,2 % атомов в молекуле фенилаланина замещены на дейтерий (рис. 3,а). Следует отметить, что вышеобозначенные атомы дейтерия врубаются в молекулу фенилаланина за счет процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы, потому что маловероятно, что они заместились в в процессе выделения аминокислоты из культуральной воды либо при хим модификации фенилаланина. Что касается протонов (дейтеронов) при гетероатомах в NH2-, NH-, и -COOH группах аминокислот, то они за счёт лёгкости диссоциации просто обмениваются на дейтерий даже при растворении аминокислот в D2O. Потому что все этапы, связанные с обработкой культуральной воды, содержащей дейтерий и её хим модификации проводились с внедрением немеченных компонент, растворителей и в т.ч. аква смесей, то эти протоны (дейтероны) из-за лёгкости диссоциации сложнее всего поддаются четкому подсчёту и контролю. Это могло служить предпосылкой маленького расхождения результатов при подсчёте степеней дейтерированности аминокислот.
Во всех исследуемых образчиках культуральной воды B. methylicum не считая основной секретируемой аминокислоты (фенилаланин), обнаружены примеси (на уровне 3-5 мМ) метаболически связанных с ним аланина, валина и лейцина (изолейцина) (см., к примеру рис 3,а). Как видно из рис.3,а, изотопный состав аланина характеризовался повышением молекулярной массы на 2,5 единицы, валина-3,5 единицы, а лейцина (изолейцина)-4,6 единицами. Таким макаром, в отличие от фенилаланина, количество включенного дейтерия в последних 3-х аминокислотах сохраняет размеренное всепостоянство в достаточно широком интервале концентраций D2O в среде (от 49 об.% до 98 об.%).
Контроль за включением дейтерия в фенилаланин за счет ассимиляции дейтерометанола при росте микробов на среде, содержащей обыденную воду и 2% СD3OD (соответствуют опыту 2, табл.1) показал малозначительное количество дейтерия, которое поступает в молекулу фенилаланина совместно с углеродом СD3OD. Процент дейтерирования фенилаланина был оценен по величине пика 413 за вычетом вклада пика примеси природного изотопа (менее 4 %, масс-спектр не приведён). Приобретенный итог может быть обоснован разбавлением дейтериевой метки за счёт протекания как биохимических процессов, связанных с распадом дейтеро-метанола при его усвоении клеточкой, так и реакциями изотопного обмена и диссоциации. К примеру, из четырёх атомов дейтерия, имеющихся в молекуле СD3OD, только атом дейтерия при гидроксильной группе —OD самый подвижный и потому просто диссоциирует в аква среде с образованием СD3OH. Три оставшихся атомов дейтерия в составе СD3OH входят в цикл ферментативного окисления метанола, который также мог привести к потере дейтерия за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. А именно, приобретенный итог по уровню включения дейтерия в фенилаланин подтверждает традиционную схему ферментативного окисления метанола до метаналя в клеточках метилотрофов, который только после чего ассимилируется у данного штамма метилотрофных микробов рибулозомонофосфатным методом фиксации углерода [15].
Потому что базисный штамм продуцент фенилаланина был ауксотрофом по лейцину, то разумеется, что уровни включения дейтерия в секретируемый L-фенилаланин на фоне наибольших концентраций тяжеленной воды, могут быть ниже на теоретическом уровне допустимых, вследствие функционирования в клеточке ряда биохимических реакций, связанных с ассимиляцией протонированного L-лейцина снаружи. Отмеченная особенность проявляется при биосинтезе L-фенилаланина на дейтерированной среде, в какой кроме метанола источником дополнительных протонов является немеченный лейцин. Так, в фенилаланине, приобретенном со среды, содержащей 98 об.% D2О и 2 об.% СН3ОН, только 6 атомов (из восьми обсуждаемых) в молекуле биосинтетически замещены на дейтерий (М+. с m/z 418 заместо 412) (Масс-спектр приведён на рис. 3,б). Эти два незамещенные атома водорода могли происходить из лейцина и метанола, но создатели не исключают, что схожий эффект является результатом не ассимиляции протонированных субстратов, а вкладом протонов солей в составе ростовой среды. Следует выделить, что в этом масс-спектре фиксируется пик обогащённого дейтерием бензильного куска с m/z 97 (заместо 91 в контроле), что показывает на то, что местами локализации атомов дейтерия в молекуле фенилаланина являются положения С1-С6 ароматичных атомов и сопредельное с ними положение при углеродном атоме b. При этом, как миниум четыре из их могут быть локализованы в самом бензольном кольце молекулы фенилаланина.
Масс-спектрометрический анализ консистенций дейтерий меченных аминокислот белковых гидролизатов B. methylicum.
Общие принципы исследования степени дейтерированности аминокислот при данном методе введения метки были также продемонстрированы на примере анализа сложных мультикомпонентных консистенций, приобретенных после гидролиза белка биомассы. В качестве примера на рис.4,б (относительно контрольных критерий (а) приведен масс-спектр дериватизованного белкового гидролизата, приобретенного со среды, содержащей 49 об.% D2O и 2 об.% СН3ОН (табл.1, опыт (5)). Как видно из рис.4, до 10 аминокислот могут быть идентифицированы в масс-спектре гидролизата белка, приобретенного после обработки дансилхлоридом и диазометаном. Для личных аминокислот белковых гидролизатов количество включенных атомов дейтерия по скелету молекулы варьирует в границах 49 %-ной концентрации D2O и составляет от 36,2 % для L-валина до 45,0 % для L-фенилаланина (рис. 4,б).
Вследствие того, что большой энтузиазм представляет внедрение данного штамма метилотрофных микробов для выработки униформно меченного белка и аминокислот, было нужно изучить уровни включения дейтерия в аминокислоты белковых гидролизатов B. methylicum, при росте микробов на среде, содержащей наибольшие концентрации тяжеленной воды. Данные по степеням включения дейтерия в аминокислоты белка B. methylicum, приобретенного со среды, содержащей 98 об.% D2O и 2 об.% СD3ОD (табл.1, опыт (10)) представлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, для таких аминокислот, как глицин и аланин дейтерирование в этих критериях близко к униформному, о чем свидетельствуют высочайшие степени включения дейтерия в эти аминокислоты, которые составляют 90 % и 97,5 % соответственно. Степень включения дейтерия в L-фенилаланин в составе гидролизатов белка биомассы в критериях очень насыщенной дейтерием среды также высока, что составляет 95 % (приблизительно 8 атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий). Низкие степени включения дейтерия в другие аминокислоты белка, сначала в лейцин (изолейцин) (49 %) в этих критериях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированном виде. По-видимому, в критериях ауксотрофности по лейцину вклад атомов дейтерия, синтезируемых de novo в степень дейтерированности самого лейцина, также метаболически близких с ним аминокислот незначителен.
ТАБЛИЦА 2.
Степени изотопного включения дейтерия в аминокислоты белка B. methylicum, приобретенного на среде, содержащей 98 об.% D2O и 2 об.% СD3OD.
Метиловые эфиры дансилпроизводных аминокислот
Молекулярные массы немеченных производных аминокислот, (М+.)
Молекулярные массы дейтерированных производных аминокислот (М+.), приобретенных на среде с 98 об% D2O и 2 об% CD3OD.
Степени изотопного включения дейтерия в аминокислоты, %
Dns-Gly-OMe
322,2
324,0
90,0
Dns-Ala-OMe
336,4
340,3
97,5
Dns-Val-OMe
364,5
368,5
50,0
Dns-Leu(Ile)-OMe
378,5
383,4
49,0
Dns-Phe-OMe
412,0
419,6
95,0
Dns-Asp-OMe
394,5
396,5
66,6
Dns-Tyr-(Dns)-OMe
662,0
668,5
92,8
Dns-Lys-(Dns)-OMe
627,1
632,4
58,9
Таким макаром, проведенные исследования проявили высшую эффективность использования штамма факультативных метилотрофных микробов B. methylicum для получения дейтерий-меченных аминокислот разной степени изотопной замещенности на дейтерий, в том числе и униформно меченных. Эти аминокислоты можно выделять как из культуральной воды, так и из гидролизатов биомассы. Выбор штамма для этих исследовательских работ представляется создателям оправданным, потому что B. methylicum характеризуется устойчивостью к наибольшим концентрациям тяжёлой воды в среде.
ЛИТЕРАТУРА.
1. Beaufrere B, Fournier V, Salle B., Putet G. // American Journal of Physiology.1992 .V.263. — N.1.P.214-220.
2. Michalczuk L., Ribnicky D. M., Cooke T. J., Cohen J. D. // Plant Physiology. — 1992. — V.100. — N.3. — P.1346-1353.
3. Fesic S. W. and Zuiderweg E. R. // Quarterly Reviews of Biophysics. — 1990. — V.23. — N.2. — P. 97-131.
4. McIntosh L. P. and Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. — 1990. — V. 23. N.1. P. 1-38.
5. Katz J., and Crespi H. L. // Pure Appl. Chem. — 1972. — V.32. — P. 221-250.
6. Shimamura M., Kamada S., Hayashi T., Naruse H., Iida Y. // Journal of Chromatography. — 1986. — V.374. — N.1. — P. 17-26.
7. Hruby V. // J. Synth. and Appl. Isot. Labelled Compounds. — 1985. — V.4. — P. 287-292.
8. LeMaster D. M. // Quarterly Reviews of Biophysics. — 1990. — V.23. — P.133-174.
9. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. — 1994. — V.6. — P.165-176.
10. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. — 1993. — Т.9. — С.16-20.
11. Миллер Дж. Опыты в молекулярной генетике. — М.: Мир, — 1976. — С. 393.
12. Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — V.37. — N.8. — P.911-918.
13. Vetter W , in: Biochemical Applications of mass-spectrometry (Walles G.R., and Dormor O.C.). — 1980. — First supplementary volume. — Wiley — Interscience. — N.Y. — USA. — P.439.
14. Campbell J., Weiner W.C., Chess E.K. et al. // Biomedical inveron. mass spectrom. — 1990. — V.19. — P.520-522.
15. Nesvera J., Patek M., Hochmannova J. et al., Appl. Microbiol. 35, 777-780, (1991).