Биосинтез инозина высочайшего уровня дейтерированности
Биосинтез инозина высочайшего уровня дейтерированности
БИОСИНТЕЗ 2H-МЕЧЕНОГО ИНОЗИНА Высочайшего УРОВНЯ ДЕЙТЕРИРОВАННОСТИ
О. В. МОСИН
В текущее время в мире вырастает энтузиазм к получению природных на биологическом уровне активных соединений (БАС), меченных размеренными изотопами (2Н, 13С, 15N, 18О и др), которые нужны для бессчетных биохимических и исследовательских целей [1], структурно-функциональных исследовательских работ [2], также для исследования клеточного метаболизма [3]. Тенденции к желательному использованию размеренных изотопов по сопоставлению с радиоактивными аналогами обоснованы отсутствием радиационной угрозы и возможностью определения локализации метки в молекуле спектроскопией 1Н ЯМР [4, 5], ИКи лазерной спектроскопией [6], также масс-спектрометрией [7]. Развитие технической и компъютерной оснащенности аналитических способов позволило значительно повысить эффективность проведения био исследовательских работ de novo, также учить структуру и механизм деяния БАС на молекулярном уровне [8]. Огромное научно-прикладное значение в этом нюансе имеют соединения нуклеиновой природы, содержащие дейтериевую метку в углеродном скелете молекулы [9]. А именно, 2Н-меченые рибонуклеозиды в ближнем будущем сумеют отыскать применение в матричных синтезах молекул дейтерированных РНК для исследования их пространственной структуры и конформационных конфигураций [10].
Принципиальным моментом в исследовательских работах с применением изотопно меченых БАС является их доступность. Дейтериймеченые БАС могут быть синтезированы с внедрением хим, ферментативных и биосинтетических способов [11, 12]. Но хим синтезы нередко многостадийны, требуют огромных расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят к конечному продукту, представляющему из себя рацемическую смесь Dи L-форм, для разделения которых требуются особые способы [13]. Более тонкие синтезы меченых БАС связаны с композицией хим [14] и ферментативных подходов [15, 16]. Стратегия синтеза изотопно-меченых БАС более тщательно освещена в работе ЛеМастера [17].
Для многих научно-практических целей биотехнология предлагает другой хим синтезу биосинтетический способ получения дейтериймеченых БАС, который приводит к высочайшим выходам синтезируемых товаров, к действенному включению дейтерия в молекулы и к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений [18]. Обычным подходом при всем этом остается предложенный Креспи способ выкармливания штаммов-продуцентов в средах с наивысшими концентрациями дейтерия [19]. Но главным препятствием является недочет 2Н-меченых ростовых субстратов с высочайшим уровнем дейтерированности. Сначала это связано с ограниченной доступностью и накладностью самого высокоочищенного дейтерия, выделяемого из природных источников. Природная распространенность дейтерия составляет только 0.015% (относительно полного количества элемента), но невзирая на низкое содержание дейтерия в пробах разработанные в последние годы способы обогащения и чистки позволяют получать 2Н-меченые субстраты высочайшего уровня изотопной чистоты [20].
Начиная с первых тестов Даболла и Кокса по выращиванию природных объектов в тяжеленной воде, разрабатываются подходы с внедрением гидролизатов 2Н-меченой биомассы как ростовых субстратов для синтеза штаммов-продуцентов БАС [21, 22]. Но опыты нашли бактериостатический эффект 2Н2О, заключающийся в ингибировании жизненно-важных функций клеточки, оказываемой 40% 2Н2О на растительные клеточки [23] и 80-90% 2Н2О на клеточки простых и микробов [24]. Пробы использовать для синтеза в 2Н2О природных объектов различной таксономической принадлежности, включая бактерии, микроводоросли [25] и дрожжи [26] предпринимались в течение долгого времени. Но широкого распространения в биотехнологии они не получили ввиду трудности синтеза, использования сложных всеохватывающих ростовых сред, трудности технологической схемы синтеза и т. п. Потому целый ряд практических вопросов биосинтеза 2Н-меченых БАС в 2Н2О остается не выясненным.
Более перспективны схемы синтеза с внедрением в качестве 2Н-меченых ростовых субстратов биомассы метилотрофных микробов, ассимилирующих метанол по рибулозо-5-монофосфатному (РМФ) и сериновому пути фиксации углерода, энтузиазм к которым растет благодаря насыщенному развитию технологии хим синтеза метанола [27, 28]. Уровень ассимиляции биомассы метилотрофов клеточками простых организмов и эукариот составляет 85-98%, а их производительность, измеренная по уровню биоконверсии метанола в клеточные составляющие, добивается 50% [29]. Как было показано нами преждевременное, метилотрофные бактерии очень нетребовательные объекты, вырастают на малых средах с 2-4% метанолом, в каких другие контаминантные бактерии не плодятся и довольно просто приспосабливаются к наибольшим концентрациям 2Н2О, что значительно для синтеза 2Н-меченых БАС [30, 31]. Большой научно-практический энтузиазм к использованию дейтерированной метилотрофной биомассы для синтеза продуцентов рибонуклеозидов обусловил цель истинной работы, связанной с исследованием принципной способности биосинтеза 2Н-меченого инозина штаммом Bacillus subtilis за счет использования гидролизата факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum.
Таблица 1. Изотопный состав ростовых сред и биосинтетические свойства B. methylicum
Номер опыта
Составляющие среды, об.%
H2O 2H2O Метанол [U-2H]
Метанол
Лаг-период, ч
Выход микробной биомассы, % от контроля
Время генерации, ч
1
98
0
2
0
20
100
2.2
2
98
0
0
2
30
92.3
2.4
3
73.5
24.5
2
0
32
90.6
2.4
4
73.5
24.5
0
2
34
85.9
2.6
5
49.0
49.0
2
0
40
70.1
3.0
6
49.0
49.0
0
2
44
60.5
3.2
7
24.5
73.5
2
0
45
56.4
3.5
8
24.5
73.5
0
2
49
47.2
3.8
9
0
98.0
2
0
58
32.9
4.4
10
0
98.0
0
2
60
30.1
4.9
10’
0
98.0
0
2
40
87.0
2.8
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Для синтеза 2Н-меченого инозина использовали мутантный штамм грамположительных микробов Bacillus subtilis (за ранее приспособленный к дейтерию скринингом до отдельных колоний), который из-за нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых рибонуклеозидов синтезирует в стандартных критериях выкармливания (дрожжевая среда, поздний экспоненциальный рост, 32-340С) 17 г инозина на 1 л культуральной воды (КЖ) [32]. Наибольший выход инозина достигался при использовании природной протонированной среды, содержащей в качестве в качестве источников ростовых причин и аминного азота 2% БВК дрожжей, а в качестве источника углерода и энергии глюкозу (более 12 мас.%). При проведении синтеза требовалось поменять протонированные ростовые субстраты их дейтерированными аналогами, также использовать 2Н2О высочайшего уровня изотопной чистоты. Для решения намеченной цели использовали приспособленный к дейтерию штамм факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum с 50% уровнем биоконверсии метанола (при эффективности конверсии 15.5-17.3 г сух. биомассы на 1 г потребленного субстрата) [33].
Проведение адаптации для B. methylicum определялось необходимостью сделать лучше ростовые свойства штамма в очень дейтерированной среде, потому использовали ступенчато-увеличивающийся градиент концентрации 2Н2О в ростовых средах в присутствии 2% метанола (табл. 1). Для исследования воздействия уровня дейтерированности источника углерода на ростовые характеристики штамма в опытах (1, 3, 5, 7 и 9) использовали протонированный метанол, а в опытах (2, 4, 6, 8 и 10) [U-2Н]метанол. Согласно приобретенным данным подмена протонированного метанола его дейтерированным аналогом в критериях схожей концентрации 2Н2О в среде приводила к маленьким уменьшениям ростовых черт штамма (табл. 1, опыты 2, 4, 6, 8 и 10). Потому в последующих опытах использовали среды с 2Н2О и [U-2Н]метанолом.
На контрольной протонированной среде (1) с водой и метанолом длительность лаг-периода и времени клеточной генерации B. methylicum составили 20 и 2.2 ч, а выход микробной биомассы 200 г с 1 л КЖ (табл. 1, опыт 1). В промежных опытах (2-10) биосинтетические характеристики изменялись пропорционально концентрации 2Н2О. Отысканная закономерность заключалась в увеличении длительности лаг-периода и времени клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы с фиксированием самых низких значений этих характеристик в очень дейтерированной среде с 98% 2Н2О и 2% [U-2H]метанолом (табл. 1, опыт 10). За ходом адаптации, условия которой показаны в опыте 10’ (табл. 1) следили, снимая динамики роста начального (б) и приспособленного к дейтерию (в) штамма в очень дейтерированной среде М9 (рис. 1, контроль (а) получен в протонированной среде), также по изменению длительности лаг-периода, времени генерации и выходов микробной биомассы (рис. 2). В отличие от приспособленного штамма (в), ростовые динамики начального штамма (б) в наибольшей дейтерированной среде ингибировались дейтерием (рис. 1).
Выход микробной биомассы у приспособленного штамма (в) уменьшался на 13% по сопоставлению с контрольными критериями (рис. 2, а) при увеличении времени генерации до 2.8, а длительности лаг-периода до 40 ч (рис. 2, в). Приспособленный штамм ворачивался к нормальному росту при переносе в протонированную среду после пролонгированного лаг-периода, что обосновывает фенотипическую природу парадокса адаптации, хотя на теоретическом уровне не исключается, что эффект реверсии размеренно сохраняется при росте в 2Н2О, но маскируется при переносе клеток в протонированную среду. Усовершенствованные ростовые свойства приспособленного метилотрофа существено упрощают схему синтеза 2Н-меченой биомассы, хорошим условиям которой удовлетворяет очень дейтерированная среда М9 с 98% 2Н2О и 2% [U-2Н]метанолом с инкубационным периодом 5-6 сут при 370С.
Схема синтеза 2Н-меченого инозина разрабатывалась с учетом возможности метилотрофных микробов синтезировать огромное количество белка (выход 50% от веса сухого вещества), 15-17% полисахаридов, 10-12% липидов (в главном, фосфолипиды) и 18% зольных веществ [34]. Гидролиз биомассы проводили автоклавированием в 0.5 н. 2НCl (в 2Н2O), чтоб обеспечить высочайшие выходы этих соединений и минимизировать реакции оборотного (1Н-2Н) обмена в аминокислотных остатках молекул белков. Высококачественный и количественный состав ароматичных аминокислот метилотрофного гидролизата изучали в дейтерированной среде М9 на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) с сульфированной смолой UR-30, а уровни дейтерированности молекул масс-спектрометрией электрического удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот. Гидролизат представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (кроме пролина, который детектировался при 440 нм) при выходах аминокислот, сопоставимом с потребностями штамма в источниках углерода и аминного азота (табл. 2). При всем этом индикатором, определяющим высшую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит высочайший уровень дейтерированности молекул аминокислот, который варьирует от 49% для лейцина/изолейцина до 97.5% для аланина (табл. 2).
Биосинтетические свойства штамма B. subtilis снимали в протонированной дрожжевой среде с обыкновенной водой и синтетической тяжеловодородной среде с 2Н2О и 2% 2Н-меченым метилотрофным гидролизатом B. methylicum (рис. 3). Отмечена корреляция в нраве конфигурации ростовых динамик (рис. 3, 1а, 2а), выхода инозина (рис. 3, 1б, 2б) и ассимиляции глюкозы (рис. 3, 1в, 2в). Наибольший выход инозина (17 г/л) зафиксирован в опыте 1б (рис. 3, 1б) на протонированной среде при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 3, 1в). На тяжеловодородной среде выход инозина снижался в 4.4 (3.9 г/л) (рис. 3, 2б), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л неассимилируемой глюкозы в КЖ (рис. 3, 2в).
Таблица 2. Аминокислотный состав метилотрофного гидролизата и уровни дейтерированности молекул
Аминокислота
Выход, % от сухого веса 1 г биомассы
Величина молекулярного иона Мr
Количество включенных атомов дейтерия
в углеродный скелет молекулы
Уровень дейтерированности молекул, % от полного количества атомов водорода
Глицин
9.69
324
2
90.0
Аланин
13.98
340
4
97.5
Валин
3.74
369
4
50.0
Лейцин
7.33
383
5
49.0
Изолейцин
3.64
383
5
49.0
Фенилаланин
3.94
420
8
95.0
Тирозин
1.82
669
7
92.8
Серин
4.90
355
3
86.6
Треонин
5.51
не детектировался
?
?
Метионин
2.25
не детектировался
?
?
Аспарагин
9.59
396
2
66.6
Глутаминовая кислота
10.38
411
4
70.0
Лизин
3.98
632
5
58.9
Аргинин
5.27
не детектировался
?
?
Гистидин
3.72
не детектировался
?
?
Приобретенный итог добивался исследование содержания глюкозы в биомассе штамма после гидролиза, осуществленное способом обращенно-фазовой ВЭЖХ (табл. 3). Смесь гидролизных сахаров в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки) составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды (мальтоза, сахароза), также четыре других неидентифицированных сахара с периодически удерживания 3.08 (15.63%), 4.26 (7.46%), 7.23 (11.72%) и 9.14 (7.95%) мин (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21.4% от сух. веса, другими словами выше, чем фруктозы (6.82%), рамнозы (3.47%), арабинозы (3.69%) и мальтозы (11.62%). Их выхода значительно не отличались от контроля на Н2О, кроме сахарозы, не детектируемой в дейтерированном гидролизате.
Таблица 3. Состав сахаров гидролизата штамма-продуцента
Сахар Выход, % от сухого веса 1 г биомассы
протонированная среда тяжеловодородная среда
Глюкоза
20.01
21.4
Фруктоза
6.12
6.82
Рамноза
2.91
3.47
Арабиноза
3.26
3.69
Мальтоза
15.3
11.62
Сахароза
8.62
?
Применение сложных физико-химических способов для выделения биосинтетически 2Н-меченого инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высочайшей степени хроматографической чистоты. Так как в КЖ вместе с синтезируемым продуктом находятся примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, также сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводили ступенчатое фракционирование КЖ. Завышенная чувствительность инозина к кислотам и щелочам и его непостоянность при выделении диктовали внедрение кислотных и щелочных смесей низкой концентрации, также по-возможности проводить выделение при низких температурах, избегая долгого перегрева обскурантистской консистенции.
Фракционирование КЖ заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями ацетоном и метанолом, твердофазной адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстрактивного извлечения продукта, перекристаллизации и ионообменной хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемператрным осаждением ацетоном при -40С, проводя следующую адсорбцию суммы рибонуклеозидов активированным углем на холоду. Десорбированные рибонуклеозиды извлекали из прореагировавшей жесткой фазы элюцией этанольно-аммиачным веществом при 600С, а сам инозин экстракцией 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) с следующей перекристаллизацией в 80% этаноле. Окончательная стадия чистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0.3 М NH4-формиатным буфером с 0.045 М NH4Cl с ТСХ контролем при Rf 0.5. Данные по выделению инозина из КЖ штамма-продуцента представлены в виде спектров УФ-поглощения на рис. 4, а-в. Наличие в синтетическом образчике (в) основной полосы поглощения I, соответственной нативному инозину (lmax 249 нм, e249 7100 М-1 см-1) и отсутствие вторичных метаболитов II и III безоговорочно обосновывает его однородность и тем эффективность разработанного способа выделения со степенью хроматографической чистоты 92%.
Уровень дейтерированности инозина изучили способом масс-спектрометрии FAB из за высочайшей чувствительности, позволяющей детектировать 10-8-10-10 моль вещества в пробе, что значительно выше чем при использовании 1Н ЯМР-спектроскопии [7]. Пути фрагментации молекулы способом FAB приводят к распаду инозина на кусок рибозы А с Мr при массовом соотношении m/z 133 и гипоксантиновый кусок Б c Мr m/z 136 (их распад сопровождался миграцией протона Н+), который в свою очередь расщепляется на ряд наименее низкомолекулярных осколочных фрагментов В, Г, Д, Е и Ж при m/z 109, 108, 82, 81 и 54 за счет элиминирования НСN и СО из гипоксантина (схема).
Биосинтетический 2Н-меченый инозин (масс-спектр приведен на рис. 5, б относительно контроля (а)), представлен консистенцией изотопнозамещенных форм молекул с разным количеством атомов водорода, замещенных на дейтерий. Подсчет уровня дейтерированности молекулы инозина определяли, сравнивая величины пиков молекулярных ионов Мr инозина дейтерированного и протонированного образцов (формирование пика молекулярного иона инозина сопровождалось миграцией протона Н+). Пик (М+Н)+ полиморфно расщеплялся на отдельные кластеры с примесью молекул со статистическим набором массовых чисел m/z с разным вкладом в суммарный уровень дейтерированности с включением 4 (m/z 273, 20%), 5 (m/z 274, 38%), 6 (m/z 275, 28%) и 7 атомов дейтерия (m/z 276, 14%) (табл. 4).
Суммарный уровень дейтерированности молекулы (УД), вычесленный по приводимой ниже формуле составил 61% от полного количества атомов водорода в углеродном скелете молекулы.
Анализ масс-спектра FAB выявил включение атомов дейтерия в рибозный и гипоксантиновый куски молекулы, что доказано присутствием 2-ух “томных” пиков фрагментов рибозы А m/z 136, 46% (заместо m/z 133, 41%) и гипоксантина Б m/z 138, 55% (заместо m/z 136, 48%), также пиков низкомолекулярных фрагментов, товаров распада гипоксантина В m/z 111, 49% (заместо m/z 109, 45%) и Г m/z 84, 43% (заместо m/z 82, 41%) (рис. 5).
Таблица 4. Величины пиков (М+Н)+ в масс-спектрах FAB и уровни дейтерированности инозина
Величина пика (М+Н)+
Вклад в уровень дейтерированности, дескать.%
Количество атомов дейтерия
Уровень дейтерированности, % от полного количества атомов водорода
273
20
4
20.0
274
38
5
62.5
275
28
6
72.5
276
14
7
87.5
Эффект множественного мечения определяется методом получения дейтерированных молекул и свидетельствует о недостаточно высочайшей селективности биосинтетической схемы, повысить которую может быть контролем изотопного состава синтетической ростовой среды и исключения источников дополнительных протонов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования проводили с на генном уровне маркированным штаммом грамположительных микробов Bacillus subtilis ВКПМ В-3157, продуцентом инозина, приспособленным к дейтерию рассевом до отдельных колоний на 2% агаре с 2Н2О и следующей селекции по признаку стойкости к 2Н2О.
В работе использовали 2Н2О (99.9 ат.% 2Н), 2НСl (95.5 ат.% 2Н) и [U-2H]метанол (97.5 ат.% 2Н) (ЗАО Изотоп, Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, Lглюкозу (Reanal, Венгрия) за ранее перекристаллизовывали в 2Н2О, 2H2O дистиллировали над перманганатом калия с следующим контролем изотопной чистоты 1Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ) (Частота 70 МГц). Масс-спектры электрического удара ЭУ получены на приборе МB-80A (Hitachi, Япония) с двойным фокусированием (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющее напряжение 8 кВ, температура катодного источника 180-2000С) после модификации в метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных производных аминокислот по разработанной преждевременное методике [7]. Масс-спектры FAB получены на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США), снабженным цезиевым источником Cs+ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА. УФ-спектры регистрировали на программируемом спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в спектре длин волн 220-280 нм. Центрифугирование производили на центрифуге Т-24 (ФРГ) с остыванием при -40С. Аналитическую обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters K-401 (ФРГ) на колонке Separon С18 (250 x 10 мм), элюция консистенцией ацетонитрил : вода, 75 : 25, об.%, скорость элюирования 0.6 мл/мин. Ионообменную хроматографию производили на катионообменной колонке Biotronic LC-5001 (ФРГ) (230 x 3.2) с сульфированной стирольной (7.25% сшивки) смолой UR-30 (Beckman-Spinco, США); рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи Na+-цитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм. Уровень биоконверсии углеродного субстрата определяли, используя глюкозооксидазу (КФ 1.1.3.4) как описано в работе [35].
Биосинтетический 2Н-меченый инозин. Получен с выходом 3.9 г/л на синтетической тяжеловодородной среде (89-90% ат. 2Н), используя в качестве источника 2Н-меченых ростовых субстратов гидролизат биомассы метанол-ассимилирующего штамма факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662 (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. 2НСl 30-40 мин при 08 ати), выделенный скринингом в критериях многостадийной адаптации на жесткой среде М9 (2% агар) с 2% [U-2Н]метанолом со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации тяжеленной воды (от 0 до 98% 2Н2О). Состав синтетической тяжеловодородной среды (мас.%): глюкоза — 12; 2Н-меченый гидролизат B. methylicum — 2; NH4NO3 — 2; MgSO4 . 7H2O — 1; Са2СО3 — 2. Синтез проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (заполнение средой 100 мл) в течение 5-6 сут при 30-320С в критериях насыщенной аэрации обскурантистской консистенции на орбитальном шейкере S-380 (Венгрия).
Чистка 2Н-меченого инозина. Пробы КЖ центрифугировали при 2000 g, 10 мин, концентрировали при 10 мм рт. ст., добавляли ацетон при 00С (3 x 5 мл). Смесь выдерживали 14-15 ч при -40С, осадок отделяли центрифугированием при 1200 g, 5 мин. К супернатанту добавляли 10 г активированного угля, выдерживали 2 сут при 40С. Водную фракцию отделяли фильтрованием, к жесткой фазе добавляли 20 мл 50% этанола в 25% аммиаке (1 : 1, об.%), кипятили при 600С с оборотным водяным холодильником. Через 2-3 ч смесь фильтровали и упаривали при 10 мм рт. ст. Продукт экстрагировали 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9), промывали ацетоном (2 x 10 мл), сушили над безводным СaCl2. Инозин перекристаллизовывали из 80% этанола, очищали способом ионообменной хроматографии на откалиброванной колонке Biorad (150 x 10 мм) с катионообменной смолой АG50WX 4 (Pharmacia, США), уравновешенной 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН 8.9) c 0.045 М NH4Cl в критериях изократической элюции (хроматографическая чистота 92%). Контроль чистоты проводили способом ТСХ с внедрением стандартного набора рибонуклеозидов компании Beckman-Spinco (США) на хроматографических пластинках (150 x 150 мм) с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Чехословакия) в системе растворителей: H-бутанол : уксусная кислота : вода, 2 : 1 : 1, об.%. Выход 2.5 г/л (64%). Т. пл. 68-700С. [a]D20 1.610 (с 1.5 этанол). Rf 0.5. рКa 1.2 (фосфатный буфер, рН 6.87). УФ-спектр (0.1 н. НСl) (lmax 249 нм, e249 7100 М-1 см-1); FAB-спектр (глицериновая матрица Cs+, ускоряющее напряжение 5 кВ, ионный ток 0.6-0.8 мА): (M+H)+ m/z (I,%): 273, 20% (4 ат. 2Н); 274, 38% (5 ат. 2Н); 275, 28% (6 ат. 2Н); 276, 14% (7 ат. 2Н), (А + H)+ 136, 46%; (Б + Н)+ 138, 55%; (Б — НCN)+ 111, 49%; (В — HCN)+ 84, 43%.
Мосин О.В.
Перечень ЛИТЕРАТУРЫ
1. Young V.R., Yu Y.M., Krempf M. Protein and amino acid turnover using the stable isotopes 15N, 13C, and 2H as probes. in: New techniques in nutritional research // Whitehead R. G. (ed). Acad. Press. N. Y. 1990. V. 9. Р. 17-72.
2. Hruby V.J. // Synth. and Appl. Isot. Label. Compounds. 1985. V. 4. ?1. Р. 287-292.
3. Nelson J.E., Ruo T.I. // Clinica Chemica Acta. 1988. V. 175. ? 3. Р. 59-65.
4. Stockman B.J., Reily M.D., Westler W.M., Ulrich E.L., Markley J.L. // Biochemistry. 1989. V. 28. ? 7. Р. 230-236.
5. McIntosh L.P., Dahlquist F.W. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. ? 1. Р. 1-38.
6. Argade P.V., Rothschild K.J., Kawamoto A.H., Herzfeld J., Herlihy W. C. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. № 3. P. 1643-1646.
7. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1996. Т. 22. ? 10-11. С. 856-869.
8. Darmaun D., Robert J. J., Bier D.M., Mathews D.E., Young V.R. // Annales-d’ Endocrinologie. 1985. V. 46. ? 4. Р. 355-356.
9. Shvets V.I., Yurkevich A.M., Mosin O.V., Skladnev D.A. // Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V. 8. ? 4. P. 231.
10. Fesik S.W., Zuderweg E.R.P. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. № 2. Р. 97-131.
11. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. //Биотехнология. 1996. № 10. С. 24-40.
12. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биоорган. химия. 1995. Т. 21. ? 3. С. 163-178.
13. Daub G. H. Syntheses with stable isotopes. in: Stable Isotopes, Proc. of the 3d Intern. Conference // Klein E. R. (ed). Academic Press. N. Y. 1979. Р. 3-10.
14. van der Berg E.M.M., van Liemt, Willem B.S // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. ? 9. Р. 304-313.
15. Walker T. E., Matheny C. // J. Org. Chem. 1986. V. 51. Р. 1175-1179.
16. Фалеев Н.Г., Рувинов С. В., Сапоровская Н. В., Беликов В. М., Закомырдина Л.Н. // Изв. Ан. СССР. Сер. хим. 1989. Т. 10. Вып. 3. С. 2341-2343.
17. LeMaster D. // Quart. Rev. Biophys. 1990. V. 23. ? 2. Р. 133-174.
18. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. V. 62. ? 2. P. 225-229.
19. Crespi H.L., Marmur J., Katz J.J. // Nature. 1962. V. 84. ? 1. Р. 3489-3491.
20. Crespy H.L. Stable Isotopes in the Life Sciences. International atomic energy agency Press. Vienna. 1977. Р. 111-121.
21. Daboll H.F., Crespi H.L., Katz J.J. // Biotechnol. Bioengineer. 1962. V. 4. ? 5. Р. 281-297.
22. Cox J., Kyli D., Radmer R. // Trends Biotechnol. 1988. V. 6. № 12. Р. 279-282.
23. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. // Изв. РАН. Сер. биол. ? 3. С. 1-10.
24. Thomson J. F. Biological effects of deuterium. Pergamon Press. N. Y. 1963. P. 1-133.
25. Еремин В.А., Чекулаева Л.Н., Харатьян Е.Ф., Островский Д.Н. // Микробиология. 1978. Т. 32. Вып. 4. С. 629-636.
26. Busujima U.K., Shimiba S., Narita K., Okada S. // Chem. Pharm. Bull. 1988. V. 36. ? 4. P. 1828-1832.
27. Colby J, Dalton H. // Ann. Rev. Microbiol. 1979. V.33. ? 6. P.481-517.
28. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. 1994. V.6. ? 2. P.165-176.
29. Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. Convertion of stable isotope labeled methanol to components of bacterial biomass, in: 6 th Eur. Conf. of Biomass for Energy. Athens. Greece, 1991. P. 234.
30. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.
31. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. // Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.
32. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская К.А., Складнев Д.А., Чеботаев Д.В., Юркевич А.М., Швец В.И. // Биотехнология. 1996 г. № 4. C. 19-27.
33. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б.,Складнев Д.А., Акимова О.Л. // Биотехнология. 1993. № 9. С. 16-20.
34. Зорина А.В, Бабусенко Е.С. Хим состав биомассы метилотрофных микробов. Современные трудности биотехнологии микробов. // Тезисы докл. юных ученых. Рига. 1987. Т. 1. № 2. С.35-40.
35. Полюдек-Фабини Р., Бейрих Т. Органический анализ. Управление по анализу органических соединений. Л.: Химия, 1981. 514 c.