Генно-инженерные способы получения изотопномеченных аминокислот и белков
Генно-инженерные способы получения изотопномеченных аминокислот и белков
Производить направленное биосинтетическое получение личных белков, меченных размеренными изотопами комфортно за счёт использования векторов экспрессии подходящих генов, ответственных за биосинтез того либо другого интересующего исследователей белка. Оправдано и целенаправлено внедрение для этих целей векторов экспрессии на базе плазмидной ДНК бактерии E. coli, к примеру, вектор экспрессии Т4 лизоцима, включающий в собственном составе плазмиду pHSe5 [118]. В итоге использования этого вектора экспрессии, были получены миллиграммовые количества Т4-лизоцима, селективно меченного размеренными изотопами азота 15N либо углерода 13C. Включение размеренных изотопов в этом случае удалось выполнить за счет роста генного конструкта E. coli на средах, содержащих [15N]или [13С]аминокислоты. Способ также может применяться для получения личных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, хороших от E. coli, к примеру, системы экспрессии на базе клеток насекомых либо млекопитающих [119].
Другие микробные системы, в каких белки экспрессируются с высочайшими выходами, также могут быть применимы для получения изотопномеченых аналогов белков. К ним относятся, сначала такие отлично изученные био объекты, как дрожжи, бактерии и бактериофаги. Так, за счёт использования перечисленных выше микробных объектов в качестве векторов экспрессии были получены препаративные количества личных очищенных [15N]белков: нуклеаза стафилококка [120], интерлейкин 1? [121], белок репрессор фага P22C2 [122], тиредоксин E. coli [123], гемоглобин [124], ?-протеаза [125], ингибитор субтилизина [126], репрессор фага ? [127], и белок людского фактора роста N-ras P21 [128].
В работе [129] описан способ получения личных [2H]белков с внедрением вектора экспрессии на базе штамма облигатных метилотрофных микробов Methylobacillus flagellatum. Способ заключается в том, что в метилотрофах клонируют структурный ген исследуемого белка. Таким способом можно получать, к примеру, [2H]?-интерфероны, отлично экспрессируемые в клеточках метилотрофов, или другие интересующие исследователей белки. Способ также позволяет вводить в молекулы аминокислот и белков другие постоянные изотопы, к примеру, 13С. В связи с этим следует выделить, что главным недочетом при использовании приобретенных данным способом [13C]аминокислот в ЯМР-исследованиях являются всё же недостаточно высочайшие уровни изотопного обогащения аминокислот, что обусловливает усложнение спектров ЯМР за счет 12C13C-спин-спинового взаимодействия меж окрестными атомами углерода в молекуле [130]. Потому что мультиквантовые резонансы близкорасположенных атомов углерода в молекуле являются главным препятствием для интерпретации спектров ЯМР, нужно использовать улучшенные способы получения [13C]аминокислот, дозволяющие лимитировать процесс разбавления метки. Так, в ближайшее время были на генном уровне сконструированы новые штаммы микробов, которые несут мутации по генам метаболизма определенного круга предшественников этих аминокислот [131]. Это дает возможность избежать разбавления метки при росте мельчайшего организма на среде, содержащей те либо другие меченые субстраты за счет ингибирования биосинтеза аминокислот de novo у данных мутантных штаммов микробов.
При выборе определенных мутаций по генам метаболизма стремятся удовлетворить как миниум двум условиям для обычного функционирования схожих на генном уровне сконструированных систем, чтоб, во-1-х, по способности понизить деградацию метки либо ее разбавление в процессе внутриклеточного синтеза немеченых предшественников de novo и во-2-х, свести к минимуму процессы перестройки меченых положений углеродного скелета молекулы за счет биосинтеза схожих интермедиантов, образующихся по сопряжённым путям биосинтеза. Данная стратегия реализована в работе [132], где сообщается о получении 2-ух на генном уровне сконструированных штаммов микробов, обозначенных как E. coli DL10 и E. coli DL11, которые несли геномные делеции, исключающие обмен атомов углерода меж интермедиаторами в процессе гликолиза и в цикле трикарбоновых кислот.
За счёт использования данных штаммов удалось получить препаративные количества [13C]аминокислот с уровнями изотопного обогащения до 95%. Схема, иллюстрирующая мутации в генах метаболизма в цикле гликолиза и трикарбоновых кислот, приведена на рис. 2. Оба сконструированных штамма микробов E. coli имели в геноме мутации, затрагивающие гены 7 ферментов главных путей метаболизма (рис. 2).
Ферменты (1-5) у штамма E. coli DL10 были инактивированы за счёт мутаций, вследствие чего он ассимилировал в качестве источников углерода и энергии сукцинат и ацетат из ростовой среды, а [1-13C]лактат добавляли в ростовую среду для компенсации метаболических потребностей клеточки и для введения 13C-метки в молекулы аминокислот, синтезируемых в процессе гликолиза.
Другой штамм микробов E. coli DL11 мог утилизировать немеченую глюкозу в качестве источников углерода и энергии по гликолитическому пути ассимиляции углерода, в то время как [1,4-13C]cукцинат и [1-13C]ацетат добавляли в ростовую среду для того, чтоб провоцировать биосинтез [13C]аминокислот, образующихся по циклу трикарбоновых кислот. Не считая того, в данном случае было нужно ввести в бактериальный геном дополнительную мутацию, связанную c геном ?-кетоглутаратдегидрогеназы, чтоб минимизировать процесс деградации метки в цикле трикарбоновых кислот.
Рис. 2. Мутации в генах метаболизма цикла гликолиза и трикарбоновых кислот (по ЛеМастеру Д. М., 1982).
Обозначения ферментов: 1 — пируватдегидрогеназа; 2 — фосфоенолпируваткарбоксилаза; 3 — фосфоенолпируваткарбоксикиназа; 4 — NAD-малатдегидрогеназа; 5 — NADP-малатдегидрогеназа; 6 — триозофосфатизомераза; 7 — альфа-кетоглутаратдегидрогеназа.