Исследование степени дейтерированности инозина
Исследование степени дейтерированности инозина
Масс-спектр приобретенного инозина приведен на рис. 4, б относительно контрольного (а) (немеченный инозин). Как видно из рис. 4, присутствие в масс-спектре дейтерированного эталона пика, соответственного катионизированному молекулярному иону инозина МН+. с m /z 274 (заместо m/z 269 в контрольных критериях), также пиков соответствующих фрагментов рибозы [C5H9O4]+с m /z 136 (заместо m/z 133) и гипоксантина [C5H4ON4]+ 138 (заместо m/z 136) подтверждает, что степень дейтерированности инозина составляет 5 атомов из 8 детектируемых по скелету молекулы (62,5 % относительно полного количества атомов водорода в молекуле). Из 5 включенных в инозин атомов дейтерия, три локализуются в рибозной части молекулы, и два атома дейтерия — в гипоксантиновом остатке. Не считая этого, в масс-спектрах инозина детектируются пики с m/z 82 и 109, которые соответствуют продуктам распада гипоксантина.
Рис. 4
При анализе степени дейтерированности инозина учитывались последующие нюансы. Во-1-х, вследствие того что протоны (дейтероны) в С’1-С’5 положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, создатели представили,что нрав биосинтетического включения дейтерия в рибозной части молекулы инозина определяется в главном функционированием ряда процессов гексозомонофосфатного ГМФ-шунта, связанных конкретно с ассимиляцией глюкозы и других сахаров. Во-2-х, бессчетные обменные процессы и внутримолекулярные перегруппировки, происходящие с ролью 2Н2O также могли приводить к специфичному включению метки по определенным позициям в молекуле инозина.Такими доступными позициями в молекуле инозина признаны сначала гидроксильные протоны -ОН и протоны при гетероатомах -NH (последние могут обмениваться на дейтерий в 2Н2O за счет кето-енольной таутомерии). Три атома дейтерия в рибозном остатке молекулы инозина могли происходить за счет функционирования бессчетных реакций ГМФ-шунта, два атома дейтерия в гипоксантине также могли синтезироваться de novo.
Достоинства разработанного способа получения высокодейтерированного инозина заключаются в последующих качествах:
-1. В возможности штамма B. subtilis к росту и биосинтезу инозина на среде, содержащей наибольшие концентрации тяжеленной воды.
-2. Подмене нужных для роста микробов субстратов на гидролизаты дейтерий-меченной биомассы метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum. При следующих ферментациях в качестве источника ростовых причин можно использовать ту же дейтерий-меченную биомассу метилотрофных микробов, или биомассу самого штамма-продуцента, содержащую в собственном составе соединения, которые могут служить источниками углерода и ростовых причин.
-3. В отсутствие огромного количества отходов: согласно схеме дейтерий-меченная биомасса штамма продуцента, за ранее гидролизованная в 2НCl ворачивается в цикл в качестве ростовых причин.
-4. В высочайшей степени изотопного обогащения дейтерий-меченного инозина.
Таким макаром, проведенные исследования подтвердили эффективность данного подхода для препаративного получения высокодейтерированного инозина. Согласно разработанной схеме можно получить несколько граммов дейтерий-меченного инозина с 1 литра культуральной воды. Подобные подходы по препаративному получению других дейтерий-меченных нуклеозидов в текущее время интенсивно изучаются.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lawrence P. McIntosh and Frederic W. Dahlquist //Quarterly Reviews of Biophysics. — 1990. — V.23. — N.1. — P.1-38.
2. Girishchandra B. Patel, G. Dennis Sprott, and Irena Ekiel. // Appl. and Environ. Microbiology. — 1993. — V.59. — No.4. — P.1099-1103.
3. LeMaster , D.M., and J.E. Cronan.// J. Biol. Chem. — 1982. — V.257. — P.1224-1230.
4. Katz J. and Crespi H.L. // Pure Appl. Chem. — 1972. — V.32. — P. 221-250.
5. Anthony C.// The biochemistry of methylotrophs. — London.:Acad. Press. — 1982. — P.430-500.
6. John Colby, Howard Dalton. // Ann. Rev. Microbiol. — 1979. — V.33. — P.481-517.
7. Webster. I.// Biotechnol. and Bioengeneery.1983. — V.25. — C.31-50.
8. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б.,Складнев Д.А., Акимова О.Л. // Биотехнология. — 1993. — N.9. — С.16-20.
9. Егорова Т.А., Мосин О.В., Еремин С.В., Карнаухова Е.Н.,Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биотехнология. — 1993. -N.8. — С.21-25.
10. Karnaukhova E.N., Mosin O.V., Reshetova O.S.Biosynthetic production of stable isotope labelled amino acids, using methylotroph Methylobacillus flagellatum. // Amino Acids. — 1993. — V.5. — No.1. — P.125.
11. Миллер Дж. // Опыты в молекулярной генетике.М.:Мир, -1976. — С.393.
12. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. — 1994. — V.6. — P.165-176.
13. Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — V.37. — N.8. — P.911-918.
14. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А. //Разработка микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. — М.:Пищевая пром-ть, -1980. — С.291-295.
15. Зорина А.В, Бабусенко Е.С. Хим состав биомассы метилотрофных микробов, современные трудности биотехнологии микробов. // Тезисы докл. юных ученых. — Рига.,1987. -С.35-40.
О. V. MOSIN
Мoscow State Academy of Fine Chemical Technology named after М.V. Lomonosov, 117571.
THE GROWTH OF BACTERIUM OF Basillus subtilis AND BIOSYNTHESIS OF INOSINE ON HIGHLY DEUTERATED MEDIUM.
The possibility for biosynthetic preparation of deuterated inosine obtained from the culture medium of inosine-producing strain B. subtilis was described. The method is based on using the deutero-compounds of facultative methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum obtained from the completely deuterated medium containing 98 v/v% 2Н2O и 2 об. v/v% С2Н3О2Н as a source of growth factors by cultivation of inosine-producing strain. The data on growth of strain of B. subtilis and biosynthesis of inosine on highly deuterated medium containing maximum concentratioms of 2H2O and deutero-compounds extracted from methylotrophic bacteria were described. The evaluation of deuterium enrichment of inosine was carried out using mass-spectrometry FAB. The data obtained testified to a high efficiency of deuterium incorporation into inosine (62,5 % hydrogen atoms are substituted with deuterium in molecule of inosine).