Исследование уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот
Исследование уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот
В истинной работе уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли способом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот, за счет сравнения молекулярных масс протонированных и 2Н-меченых производных аминокислот.
Приобретенные микробиологическим синтезом 2Н-меченые аминокислоты представляли собой консистенции изотопнозамещённых форм молекул, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Вследствие этого эффекта пики молекулярных ионов метиловых эфиров N-Dns-аминокислот в масс-спектрах были полиморфно расщеплены на кластеры за счет примеси молекул с отношениями m/z, больше либо меньше детектируемых прибором величин (М)+ с разным вкладом в суммарный уровень дейтерированности. В качестве примера на рис. 4, б приведен масс-спектр консистенции метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот приобретенных со среды с 98 об.% 2Н2О (масс-спектр приведен относительно контрольных критерий (а) на обыкновенной воде). Подсчет уровня дейтерированности молекул аминокислот проводили по величине самого насыщенного пика молекулярного иона (М)+, зарегистрированного самим масс-спектрометром; для фенилаланина — 6 (М+ при m/z 418 заместо М+ при m/z 412 для протонированного метилового эфира N-Dns-фенилаланина), для аланина -3.1 (М+ при m/z 339.5 заместо М+ при m/z 336.4), для валина -4.7 (М+ при m/z 369.2 заместо М+ при m/z 364.5), для лейцина/изолейцина -5.1 атома дейтерия (М+ при m/z 383.6 заместо М+ при m/z 378.5). Таким макаром, полное количество дейтерия в молекуле фенилаланина составило 75%, аланине -77.5%, валине -58.8%, лейцине/изолейцине 51%. Уровни дейтерированности 2Н-меченых аминокислот семейства лейцина должны быть ниже других вследствие того что лейцин добавляли в ростовую среду в протонированном виде, что подтвердилось экспериментальными данными (см. выше). В то же время биосинтез фенилаланина был косвенно связан с ауксотрофностью по лейцину, потому дейтеривая метка в молекуле самого фенилаланина также была несколько разбавлена.
Приобретенные данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к 2H2О является фенотипическим явлением, так как приспособленные клеточки ворачивались к нормальному росту и биосинтезу фенилаланина в протонированных средах после некого лаг-периода. В то же время эффект обратимости роста на 2H2O/Н2Oсредах на теоретическом уровне не исключает способности того, что этот признак размеренно сохраняется при росте в Н2О, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. В общих чертах, при переносе клеточки в дейтерированную среду она не только лишь равномерно теряет обыденную воду за счет насыщения внутриклеточной среды 2H2О, да и происходит очень резвый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех био макромолекул, включая нуклеиновые кислоты и полипептиды. Потом в процессе роста клеточки дейтерий врубается в углеродные скелеты макромолекул, образуя связи типа С-2H [17]. В связи с тем, что физико-химические характеристики С-2Н связи значительно отличаются от ее протонированного макета [18], можно представить, что клеточка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые содействуют стабилизации работы макромолекулярных компонент жизненно-важных систем, которые подверглись дейтерированию. Не исключено, что полезные эффекты, наблюдаемые при адаптации к 2H2О связаны с образованием в 2H2O конформаций 2Н-меченых макромолекул с другими структурно-динамическими качествами, чем конформаций, образованных с ролью водорода, и потому имеющих другую активность и био характеристики, подходящие для работы в 2Н2О. С другой точки зрения пространственная структура 2Н-меченых макромолекул может стабилизироваться в 2H2О за счет вторичного изотопного эффекта дейтерия и деяния 2H2О как растворителя (большая структурированность, плотность и вязкость по сопоставлению с Н2О) [19].
Суммируя приобретенные для изученного штамма данные, можно прийти к выводу об адаптивной стабилизации средством постепенного привыкания к 2Н2О и как следствие этого улучшения ростовых и биосинтетических характеристик. Выбор метилотрофных микробов в качестве модельных объектов для данных исследовательских работ представляется более целесообразным, потому что метилотрофы как организмы, реализующие RuMP и сериновый пути ассимиляции MetOH, эволюционно ординарны и довольно лабильны в генетическом нюансе и тем резвее реагируют и адаптируются к изменчивым факторам среды. В текущее время подобные подходы по адаптации других штаммов метилотрофных микробов к 2Н2О интенсивно изучаются.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. Способы получения аминокислот и белков, меченных размеренными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О. // Биотехнология. 1996. №10. С. 24-40.
2. Пшеничникова А. Б., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Способы получения дейтерированных аминокислот. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21. № 3. С. 163-178.
3. Antony C. Bacterial Oxidation of Methane and Methanol. The Biochemistry of Methylotrophs, 2 nd edn. 1982. Academic Press, London. P. 78
4. Colby J., Dalton H., Whittenbury R. Biological and biochemical aspects of microbial growth on C1 compounds. // Ann. Rev. Microbiol. 1979. V. 33. P. 481-517.
5. Karnaukhova E. N., Reshetova O. S., Semenov S. Y., Skladnev D. A., Tsygankov Y. D. 2H-and 13C-Labeled Amino Acids Generated by Obligate Methylotrophs Biosynthesis and MS Monitoring. // Amino Acids. 1994. V. 6. P. 165-176
6. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Еремин С. В., Швец В. И. Метилотрофные бактерии — источник изотопномеченых 2Ни 13С-аминокислот. // Биотехнология. 1996. №5. С. 25-34.
7. Daboll H. F., Crespi H. L., Katz J. J. Mass cultivation of algae in pure heavy water. // Biotechnol. and bioengineering. 1962. V. 4. P. 281-297
8. Crespi H. L. Stable isotopes in life sciences. Intern. atomic energy agency, Vienna, 1977. P. 111-121.
9. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих томную воду и дейтерометанол. // Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.
10. Mosin O. В., Складнев Д. А., Цыганков Ю. Д. Патент РФ 93055824/13 (Ноябрь 17, 1995)
11. Кейл Дж. Лабораторный практикум по химии. Наука. Москва. 1981. С. 56.
12. Miller J. H., Experiments in molecular genetics. 1976. Cold Spring Harbor laboratory Cold Spring Harbor, New York p 393
13. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. Биосинтетическое получение дейтериймеченного фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum. // Биотехнология. 1993. №9. С. 16-20.
14. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактериальных объектов. // Биоорганическая химия. 1996. Т. 22. № 10-11. С. 856-869.
15. Boer L de, Harder W, Dijkhuizen L Phenylalanine and tyrosine metabolism in the facultative methylotroph Nocardia sp. 239. // Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 459-465
16. Dijkhuizen L. Metabolic regulation in the actinomycete Amycolatopsis methanolica, a facultative methylotroph employing the RuMP cycle for formaldehyde assimilation. Microbial growth on C1 compounds 1996, Kluwer academic publishers, London, P. 9-15
17. LeMaster D. M. Deuterium labeling in NMR structural analysis of larger proteins. // Quart. Revs. Biophys. 1990. V. 23. №1. P. 133-174.
18. Ереми В. А., Чекулаева Л. Н., Харатьян Е. Ф., Островский Д. Н. Выкармливание микробов Micrococcus lysodeikticus на дейтерированной среде. // Микробиология. 1978. Т. 37. Вып. 4. С. 629-635.
19. Fesik S. W., Zuiderweg E. R. P. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy of isotopically labelled biological macromolecules. // Quart. Revs. Biophys. 1990. V. 23. № 1. P. 97-131.