Нанотехнология и атомы
Нанотехнология и атомы
НАНОТЕХНОЛОГИЯ И ВКЛЮЧЕНИЕ АТОМОВ ДЕЙТЕРИЯ, УГЛЕРОДА-13, АЗОТА-15, И КИСЛОРОДА-18 В МОЛЕКУЛЫ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ.
О. В. МОСИН
Столичная муниципальная академия узкой хим технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, г. Москва, проспект Вернадского, д.86
Статья посвящена развитию современных биотехнологических и химико-ферментативных способов по включению атомов дейтерия, углерода-13, азота-15 и кислорода-18 в молекулы аминокислот и белков. Рассмотрены потенциальные способности этих способов для направленного синтеза изотопномеченых молекул аминокислот и белков. Представлены собственные и имеющиеся в литературе данные по получению и использованию синтезированных меченых соединений в разнопрофильных биохимических исследовательских работах с применением способов спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной (ИК) и лазерной спектроскопии, также масс-спектрометрии.
Ключевики: постоянные изотопы; мельчайшие организмы; биосинтез; аминокислоты и белки.
ВВЕДЕНИЕ
Способ включения атомов размеренных изотопов (2Н, 13C, 15N, 18О) в молекулы — принципиальное направление в биохимических и структурно-функциональных исследовательских работах различных природных соединений и, а именно, аминокислот и белков [1-7]. Молекулы этих изотопномеченых на биологическом уровне активных соединений (БАС), приобретенные данным способом с разными уровнями изотопного обогащения, от селективно до униформно меченых, являются комфортными инструментами для разнопрофильных метаболических и биохимических исследовательских работ [8, 9], мед диагностики разных болезней [10-13], хим синтезов различных изотопномеченых соединений на их базе. К примеру, [2H]и [13C]фенилаланин и [2H]и [13C]тирозин применены в синтезах меченых аналогов пептидных гормонов и нейропептидов [14, 15].
Тенденции к желательному применению размеренных изотопов по сопоставлению с их радиоактивными аналогами обоснованы отсутствием радиационной угрозы и возможностью определения локализации метки в молекуле способами высочайшего разрешения: спектроскопией ЯМР [16-19], ИК[20, 21] и лазерной спектроскопией [22, 23], масс-спектрометрией [24, 25]. Развитие способов детекции размеренных изотопов за последние годы позволило повысить эффективность проведения бессчетных био исследовательских работ de novo, также учить структуру и механизм деяния многих клеточных БАС на молекулярном уровне, манипулируя атомами и конфигурациями молекул, что коррелирует со всеми современными нанотехнологическими эталонами.
Разработка способов включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот и белков, является животрепещущей задачей для современной биотехнологии и нанотехнологии, так как селективное введение атомов в молекулы может приводить к включению только 1-го раздельно избранного атома по определённой позиции углеродного скелета молекулы. Это очень перспективно и любопытно для нанотехнологии, когда в приобретенной молекуле бытует только один либо несколько атомов, замещённых на постоянные изотопы по определённым положениям молекулы.
Различные способы, применяемые для введения размеренных изотопов в молекулы БАС, обычно приводят к получению товаров, представляющих из себя консистенции молекул, различающихся количеством атомов, замещённых на постоянные изотопы. Потому нужно разрабатывать и использовать новые подходы по получению изотопномеченых БАС, основанные на использовании генно-инженерных способов, композиции биотехнологических и химико-ферментативных подходов и т. п.
Зависимо от цели исследования при реализации того либо другого подхода по получению изотопномеченых аминокислот и белков должны учитываться их цена, выходы, способности более полного выделения и чистки, также изотопная чистота синтезированных молекул.
При получении изотопномеченых молекул аминокислот и белков главные издержки связаны с закупкой сырья (субстрата), расходом электроэнергии (на смешивание, аэрацию и процессы массопереноса) и остыванием (термообменом). При использовании природных сырьевых источников (пептонов, белково-витаминных концентратов и т. п.) в качестве субстратов для производства изотопномеченых БАС нужно также учесть расход электроэнергии, пара и горючего на подготовительную глубокую обработку сырья, чтоб перевоплотить его в поддающиеся микробиологическому воздействию соединения. Сравнительная оценка разных методов производства изотопномеченых аминокислот и белков указывает, что главные расходы связаны со ценой сырья, составляющей 70-80% всех издержек.
Внедрение молекул аминокислот и белков, меченных размеренными изотопами, в значимой мере определяется ограниченной доступностью и накладностью самих высокоочищенных изотопов, выделяемых из разных природных источников. Природная распространенность размеренных изотопов варьирует от 0,015% (относительно полного количества элемента) для дейтерия, до 1,11% для изотопа углерода 13С, но, невзирая на низкое содержание изотопов в пробах, разработанные в последние годы высочайшие способы обогащения и чистки размеренных изотопов позволяют получать молекулы изотопно-меченных субстратов с высочайшей степени изотопной чистоты.
Невзирая на всё растущий мировой энтузиазм к молекулам изотопномеченых БАС, в российскей литературе имеются малочисленные сведения, касающиеся способов получения этих принципиальных соединений, охарактеризованных нами [26-28]. Целью истинной статьи является освещение современных способов включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот и белков.
Хим Способы ВКЛЮЧЕНИЯ АТОМОВ Размеренных ИЗОТОПОВ В МОЛЕКУЛЫ.
Хим синтез
Синтетические способы включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот представляют собой измененный традиционный синтез аминокислот, в каком стадии карбоксилирования, аминирования, восстановления, гидрирования либо гидролиза проводят с внедрением меченых реагентов, содержащих постоянные изотопы дейтерия, углерода-13, азота-15, кислорода-18 с подходящим уровнем изотопной чистоты. Так, для синтеза [2Н]-, [15N]и [18О]аминокислот употребляют тяжёлую воду, дейтероводород, дейтерохлористоводородную кислоту; LiAl2H4; B22H6; 15NH3; Na15NH2; 15NH2Cl, 18H2O и др. (более тщательно о способах получения [2H]-и [15N]аминокислот см. обзоры [29, 30]).
Необыкновенную ценность для многих исследовательских работ имеют молекулы [13C]аминокислот, которые получают за счёт карбоксилирования соответственных органических соединений при помощи 13CO2 и Ni(13CO)4 по связи углерод-водород либо углерод-металл с следующим гидролизом.
Многообещающие синтетические подходы по включению атомов углерода-13 в разные положения молекул, включая карбоксильные СООНи Сaположения, продемонстрированы в работах [31-36], также описан стереоселективный синтез молекул [13С]аминокислот [37-39]. Невзирая на это, хим синтезы многостадийны, требуют огромных расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят в итоге к продукту, представляющему из себя рацемическую смесь Dи L-форм молекул аминокислот, для разделения которых требуются особые способы [40].
Недочетом хим синтеза будет то, что он приводит к синтезу молекул [13С]аминокислот, у каких атомы углерода-13 локализуются по карбоксильным СООН-положениям молекул. Это значительно ограничивает внедрение данных [13C]аминокислот для био исследовательских работ вследствие вероятной утраты изотопной метки углерода-13 за счёт функционирования бессчетных реакций ферментативного декарбоксилирования, происходящих в организме [41]. Разработанные за последние годы синтетические способы введения атома углерода-13 в молекулы аминокислот затрагивают такие положения углеродных атомов в молекулах аминокислот, как метильная группа метионина [42], С2положение в имидазольном кольце молекулы гистидина [43], также атомы углерода при карбоксильных СООНгруппах аспарагиновой [44], и глутаминовой кислот [45].
Более тонкие методы включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот связаны с внедрением композиции хим и ферментативных подходов. Так, L-[4-13C]валин, L-[3-13C]триптофан и другие L-[13C]аминокислоты, были синтезированы с использованинем ферментов [46] (более тщательно о химико-ферментативных подходах по синтезу изотопномеченых аминокислот см ниже).
»’Изотопный (1Н-2Н)и (16О-18О)-обмен в молекулах аминокислот и белков.»’
Действенным подходом для включения атомов дейтерия в молекулы аминокислот является селективное замещение определённых просто обмениваемых на дейтерий ароматичных протонов в бензольном кольце молекул фенилаланина и тирозина, в индольном кольце триптофана и в имидазольном кольце гистидина, как в виде личных молекул аминокислот, так и в составе аминокислотных остатков в белках [47, 48].
Реакция изотопного (1Н-2Н)-обмена протекает по механизму электрофильного замещения и затрагивает определённые, более чувствительные к замещению протоны в молекулах ароматичных аминокислот. Этим способом могут быть получены в граммовых количествах L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500 C, L-[3,5-2H]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабеньком кипячении раствора, L-[2,4,5,6,7-2H]триптофан в 75% [2H]трифторуксусной кислоте при 250 С и L-[2-2H]гистидин в 6 н. NaO2H при 800 С.
Вследствие того, что замещаемые на дейтерий протоны в молекулах белков крепко связаны с атомами углерода и тяжело обмениваются на дейтерий в мягеньких критериях, способ несколько лимитируется из-за непостоянности белков в жестких критериях (85-90% НCl/H2SO4, 80-1000 C), нужных для проведения реакции изотопного обмена [49]. Не считая того, проведение изотопного обмена в более жёстких критериях сопровождается рацемизацией аминокислот. Избежать этого позволяет конкретное введение приобретенных за счёт (1Н-2Н)-обмена дейтерированных аналогов аминокислот — L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланина, L-[3,5-2H]тирозина и L-[2,4,5,6,7-2H]триптофана в молекулы личных белков, к примеру, в бактериородопсин, синтезируемый бактерией Halobacterium halobium [50].
Разработан новый способ включения атомов дейтерия в молекулы аминокислот (глицин, аланин, валин, изолейцин, серин, треонин, пролин, гистидин) реакцией высокотемпературного твёрдофазного каталитического изотопного обмена [51, 52]. В согласовании с этим способом L-аминокислота в протонированой форме реагирует с газообразным дейтерием при 200-2500 С в присутствии высокодисперстного катализатора группы платины (Pt, Pd, Rh), и неорганического носителя (BaSO4, CaCO3, Al2O3).
При помощи изотопного обмена можно включать изотоп кислорода-18 в молекулы аминокислот. Для этого употребляют реакцию изотопного (16О-18О)-обмена по атомам кислорода карбоксильных СООНгрупп в молекулах аминокислот в присутствии Н218О в качестве источника метки [53]. Внедрение этого способа лимитируется высочайшей ценой приобретенных таким методом [18О]аминокислот. Но, он стопроцентно оправдывает себя при проведении бессчетных биомедицинских исследовательских работ с применением синтезированных молекул [18O]аминокислот, потому что они, в отличие от их дейтерированных аналогов, размеренны по отношению к оборотному изотопному обмену. К примеру, [18О]аминокислоты размеренно существовали в плазме крови в течении нескольких дней после инъекции: оборотный изотопный (18О-16О)-обмен по карбоксильным положениям в молекуле [18О]тирозина и других молекулах [18O]аминокислот проявлялся только при долговременной инкубации клеток крови с питательной средой [54].
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ Способы ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ
Выкармливание микробов на средах со размеренными изотопами.
Для многих целей, и сначала для структурных исследовательских работ белков, биотехнология предлагает другой хим методу включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот и белков, который приводит к высочайшим выходам синтезируемых товаров, к действенному включению атомов изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных товаров [55, 56]. Способ заключается в выращивании штаммов-продуцентов нужных БАС на ростовых средах, содержащих разные субстраты, представляющие из себя органические соединения и неорганические соли, содержащие постоянные изотопы дейтерия, углерода-13, азота-15 и кислорода-18 [57-61].
Решающее значение для биотехнологического введения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот и белков имеет верный выбор микробов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих постоянные изотопы и к продукции подходящих БАС. Более доступными объектами для получения многих изотопномеченых белков признаны микроводоросли, огромное обилие которых в природе позволяет выбирать посреди их отдельные виды, способные к эндогенному скоплению белков [62]. В то же время всеохватывающее внедрение компонент меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, к примеру, дейтерированные аминокислоты, в том числе и гетеромеченые, из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на тяжёловодородной среде [63].
Другие классические штаммы микробов также могут отлично применяться для получения изотопномеченых молекул аминокислот и белков. Основными требованиями к микробам, применяемым для этих целей являются устойчивый рост на средах, содержащих постоянные изотопы и высочайший уровень продукции подходящих БАС, который можно повысить за счёт внедрения генно-инженерных способов, также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с данными качествами и для предстоящего исследования их черт. Биотехнологический подход экономически целесообразен и в особенности незаменим, когда нужны высочайшая стереоселективность и наибольшие уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.
При биотехнологическом включении атомов размеренных изотопов в молекулы употребляют несколько подходов, один из которых заключается в униформном обогащении размеренными изотопами молекул клеточных БАС по всему углеродному скелету молекул. Это достигается за счёт выкармливания микробов на средах, содержащих меченые субстраты высочайшего уровня изотопной чистоты и с следующим фракционированием компонент биомассы на разные классы природных соединений [64].
Молекулы аминокислот с униформным нравом включения атома углерода-13 по скелету молекулы получают, в главном, при выращивании автотрофных микробов на ростовых средах, содержащих заместо обыденных углеродных субстратов только их низкомолекулярные [13С]аналоги, к примеру 13С-диоксид углерода [65]. Таким методом были получены многие [13C]белки, синтезируемые микроводорослями: ферридоксин из Anabaena [66], цитохром C-553 [67], цитохром C2 из Rhodospirillum [68], и флаводоксин из Anabaena 7120 [69] и применены для последующих ЯМР исследовательских работ.
Для структурных исследовательских работ белков способом спектроскопии ЯМР, для которого нужно, чтоб как можно больше атомов в молекуле были замещены на их постоянные изотопы, биосинтетические подходы по получению униформно меченых молекул [13C]аминокислот могут обеспечить сравнимо дешевое получение подходящего количества меченых [13C]продуктов [70].
Включения атома азота-15 в молекулы аминокислот достигают аналогичным оковём за счёт выкармливания микробов на аква средах, содержащих К15NO3 либо другие 15N-содержащие соли [71], в то время как высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с внедрением ростовых сред, содержащих заместо обыкновенной воды 99,9% тяжёлой воды [72].
Существует ряд определённых проблем при использовании тяжёлой воды в качестве источника атомов дейтерия, так как нужно учесть эффекты, связанные с клеточной адаптацией к ней. Понятно, что тяжёлая вода действует токсически на клеточки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микробов.
Но, невзирая на нехороший биостатический эффект тяжёлой воды, различные таксономические роды микробов могут быть довольно просто приспособлены к росту и биосинтезу на средах содержащих наибольшие концентрации тяжеленной воды [73], в то время как клеточки высших растений способны выдерживать менее 60% тяжёлой воды [74], а животные клеточки менее 30% [75].
С физиологической точки зрения и генетики адаптация клеточки к тяжёлой воде является всеохватывающим феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях молекул синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клеточки. В связи с этим, разработка способов физиологической адаптации клеточки к тяжёлой воде для получения высокообогащённых дейтерием молекул БАС является очень животрепещущей задачей [76-78].
При адаптации био объектов к тяжёлой воде учитываются хим изотопные эффекты, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высочайшими [79]. Различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей хим реакций, протекающих в тяжёлой воде по отношению к таким в обыкновенной воде, измеренных как соотношение kH/k2H. Это соотношение изменяется для разных связей, образованных с ролью дейтерия и может разнообразить в границах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся конфигурации в констатнах скоростей хим реакций, обусловленных действием 2Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.).
Тяжёлая вода является гидроскопическим соединением, интенсивно всасывающем пары воды из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и, как следует, этапы, связанные с выращиванием микробов на тяжёловодородных средах нужно проводить в герметических критериях с внедрением безводных реагентов, за ранее перекристаллизованных в тяжёлой воде неорганических солей и т. п.
Атомы кислорода-18O можно включать в молекулы аминокислот за счёт выкармливания микробов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды — 18O-воду. Адаптация клеток к 18O-меченная вода не является лимитирующим шагом. Но, 18O-меченная вода употребляется в качестве источника изотопной метки в редчайших случаях, вследствие высочайшей цены изотопных соединений кислорода [80].
Селективного включения атомов размеренных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков достигается за счёт внедрения композиции меченых и немеченых субстратов в ростовых средах [81], меченых предшественников аминокислот [82], либо при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микробов [83]. Для этих целей прекрасно подходит такая распространённая амеба как E. coli, биосинтез аминокислот в какой к истинному времени исследован более детально и для которой получен бессчетный набор мутантных форм [84].
Очень нередко, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клеточке приводят к специфичному мечению других биосинтетически схожих молекул аминокислот за счёт использования клеточкой бессчетных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В неких случаях этот фактор может значительно облегчить процесс включения атомов размеренных изотопов в молекулы селективно меченых белков и аминокислот. Так был получен [15N]Т4-лизоцим, с селективным нравом включения атомов азота-15 только по остаткам глутамата, глутамина и аргинина в молекуле [85]. В работах [86, 87] сообщается о получении других личных [15N]белков, селективно меченных изотопом азота-15 по остаткам гистидина и лизина.
Внедрение ауксотрофных мутантов микробов для включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот и белков.
Внедрение ауксотрофных по определённым аминокислотам форм микробов для включения атомов размеренных изотопов в молекулы стало так пользующимся популярностью в биотехнологии, что сейчас его следует рассматривать как отдельное направление. Селективность включения атомов размеренных изотопов в молекулы достигается в итоге прибавления в ростовую среду меченого аналога соответственной аминокислоты либо её предшественника, по которым штамм ауксотрофен и которые конкретно либо через de novo биосинтетический цикл предшественников подменяют в белке нативную аминокислоту. При всем этом ауксотрофные штаммы могут относиться к разным таксономическим группам микробов, включая метаногенные и метилотрофные бактерии, биотехнологический потенциал которых для получения изотопномеченых аминокислот в текущее время общепризнан. Метаногенные бактерии, относящиеся к группе облигатных анаэробов, которые получают энергию за счет ассимиляции газовой консистенции (H2-CO2) [88, 89], в большинстве случаев употребляют для включения изотопа углерода-13. Эффективность мечения аминокислот изотопом углерода-13 достигается за счёт получения и использования ацетатзависимых мутантов метаногенных микробов, неспособных синтезировать ацетил-СоА из СО2 и вследствие этого для роста которых нужен экзогенный ацетат [90]. Потому выкармливание этих микробов проводят на ростовых средах, содержащих вместе с (H2-CO2) добавки ацетата, которые могут заменяться их [13С]аналогами. При росте этих метанотрофов на средах с (водород-13C-диоксид углерода) и [13C]ацетатом удаётся достигнуть униформного нрава включения изотопа углерода-13 по углеродным скелетам в молекулах аминокислот, также резкого уменьшения уровня включения экзогенного 13С-диоксида углерода в конечный продукт ассимиляции углерода — метан [91]. При всем этом удается практически стопроцентно избежать процесса разбавления метки в молекулах синтезируемых [13C]аминокислот.
Селективного включения атомов углерода-13 в молекулы аминокислот можно достигнуть за счёт использования ростовых сред, содержащих немеченую смесь (Н2-СО2) и [13C]ацетат или 13СО2 в составе консистенции (Н2-13СО2) и немеченый ацетат [92]. Вследствие высочайшей цены 13С-диоксида углерода и неудобств, связанных с его компрессией, включение атомов углерода-13 в молекулы в большинстве случаев производят по первому варианту, т. е. с внедрением консистенции (Н2-СО2) и [13C]ацетата. Но, как было отмечено в работах [93, 94], ацетатассимилирующим метаногенам, к примеру, Methanospirillum hungatei GP1 требуются значимые концентрации ацетата для рационального роста. Вследствие этого главным недочетом использования этих микробов является значимый расход изотопной метки.
При биотехнологическом включении атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот нужно учесть пути их биосинтеза в клеточке, которые для метаногенных микробов хотя и являются характеристичными, но несколько отличаются от узнаваемых для E. coli. Данные по биосинтезу [13C]аминокислот, приобретенных при выращивании ауксотрофной по ацетату бактерии M. hungatei GP1 в среде, содержащей (H2-CO2) и [1,213C]ацетат в качестве источников углерода и энергии, приведены ниже.
[13C]Аланин. Включение атома изотопа углерода 13С в молекулу аланина происходило за счет реакции карбоксилирования ацетил-СоА до пирувата. Таковой путь биосинтеза был продемонстрирован для других таксономических родов и видов метаногенных микробов [95].
[13C]Серин и [13C]глицин. Нрав рассредотачивания атомов изотопа углерода-13 в молекулах серина и глицина был объяснён частичным фосфорилированинем пирувата до фосфопирувата и образованием 3-фосфоенолпирувата по гликогенному пути ассимиляции углерода. Доказательством этому служат значимые уровни активности ферментовфосфоенолпируватсинтетазы, енолазы и 2-фосфоглицератмутазы, которые были обнаружены в клеточных экстрактах других метаногенов, к примеру, Methanobacterium thermoautotrophicum [96].
[13C]Аспарагиновая кислота, [13C]треонин и [13C]метионин. Включение атома изотопа углерода-13C по атому углерода a-карбоксильной группы аспартата, происходящего из C1-ацетата и по b-углеродному атому С2-ацетата и включение атома изотопа углерода-13 в карбоксильные группы аминокислот из диоксида углерода, свидетельствовало о том, что биосинтез аспартата в этой бактерии происходил через цикл трикарбоновых кислот в итоге ферментативного карбоксилирования пирувата до оксалоацетата.
Рассредотачивание атомов изотопа углерода-13 в молекулах треонина и метионина происходило в согласовании с методом биосинтеза этих аминокислот из аспартата. Атом углерода в метильной группе молекулы метионина происходил из диоксида углерода.
[13C]Лизин. Рассредотачивание атома изотопа углерода-13 в молекуле лизина свидетельствовало о том, что лизин синтезировался из пирувата и аспартата по обычному для микробов диаминопимелиновому пути [97].
[13C]Глутаминовая кислота, [13C]аргинин и [13C]пролин. В молекуле глутаминовой кислоты атомы изотопа углерода-13 детектировались в Сb и Cg положениях углеродного скелета молекулы. Атомы углерода при карбоксильной СООНгруппе молекулы глутаминовой кислоты и в a-положении происходили из диоксида углерода. Этот итог свидетельствовал о том, что цикл трикарбоновых кислот приводил к образованию a-кетоглутарата. Рассредотачивание атомов изотопа углерода-13 в молекулах аргинина и пролина аналогично таковому в глутаминовой кислоте.
[13C]Лейцин, [13C]валин и [13C]изолейцин. Нрав изотопного включения углерода-13 в молекулы лейцина и валина свидетельствовал об их образовании из a-ацетолактата, в то время как биосинтез изолейцина отличался от ожидаемого пути биосинтеза этой аминокислоты из треонина. В клеточках M. hungatei изолейцин создавался из ацетата. Аналогичный путь биосинтеза изолейцина был найден у спирохеты [98], у лейцинассимилирующего мутанта Serratia marcescens [99], и у мутанта Saccharomyces cerevisiae, у которого дефектен ген треониндезаминазы [100].
[13C]Фенилаланин и [13C]тирозин. Меченые позиции атома углерода в молекулах фенилаланина и тирозина стопроцентно совпадали с обычным для микробов методом биосинтеза этих аминокислот из шикимовой и хоризмовой кислот [101].
[13C]Гистидин. Атом углерода в положении Cg имидазольного кольца гистидина происходил из диоксида углерода. Углеродный атом в положении Сe имидазольного кольца гистидина был замещён на изотоп углерода-13 с ролью С2ацетата.
Другими многообещающими источниками изотопномеченых аминокислот и белков признаны метилотрофные мельчайшие организмы, способные ассимилировать метанол и C1-углеродные соединения по рибулозофосфатному и сериновому циклам ассимиляции углерода. Метилотрофы представленны в таксономическом нюансе грамположительными, грамотрицательными микробами и дрожжами, энтузиазм к которым в текущее время все растет благодаря разработке новых технологий хим синтеза метанола [102]. Эти бактерии завлекают внимание исследователей сначала как дешевенькие источники микробного белка и аминокислот [103, 104]. Познание путей бактериального метаболизма позволяет производить направленное введение атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот.
Метилотрофные бактерии окисляют метанол с внедрением фермента — метанолдегидрогеназы, следующие окислительные реакции катализируют формальдегиди формиатдегидрогеназа [105-108]. Только потом продукт окисления метанола в виде метаналя фиксируется клеточкой одним из 2-ух путей ассимиляции углерода: рибулозо-5-монофосфатным и сериновым [109, 110].
Мы начали отлично использовать ауксотрофные штаммы метилотрофных микробов для включения атомов размеренных изотопов дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот ещё 10 лет тому вспять. Исследования проводились на кафедре биотехнологии Столичной гос академии узкой хим технологии им. М.В. Ломоносова под управлением академика РАМН В.И. Швеца. Для этих целей мы использовали биологическую конверсию дешёвых низкомолекулярных меченых субстратов — (13С)метанола, (2Н)метанола и тяжёлой воды в клеточках метилотрофов в молекулы дорогостоящих меченых БАС [111-113]. Обычным подходом при всем этом было выкармливание соответственных штаммов-продуцентов аминокислот, устойчивых к росту на средах, содержащих постоянные изотопы водорода, углерода, азота и др. В работах [114, 115] сообщается о включение атомов изотопа углерода-13 в молекулы аминокислот (уровни включения размеренных изотопов в молекулах варьируют от 30% для L-[13C]лейцина до 90% для L-[13C]фенилаланина) за счёт использования ауксотрофных по L-изолейцину микробов Methylobacillus flagellatum.
Наши исследования проявили, что [13С]метанол в отличие от тяжёлой воды не оказывает существенного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические свойства метилотрофов [116], потому данный подход можно отлично использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (к примеру, введение изотопа углерода 13С в молекулы на фоне наибольших концентраций тяжёлой воды в ростовых средах). В работе [117] нами были получены [2H]и [13С]аминокислоты с различными уровнями изотопной обогащённости при росте ауксотрофного по L-лейцину штамма факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum и ауксотрофного по L-изолейцину штамма облигатных метилотрофных микробов Methylobacillus flagellatum на малых средах с (13С)метанолом, (2Н)метанолом и тяжёлой водой. [13C]и [2Н]аминокислоты различного уровня изотопной замещённости выделяли как из культуральных жидкостей, приобретенных после выкармливания микробов на средах с надлежащими изотопномечеными субстратами, так из гидролизатов белков биомассы.
Биосинтетически приобретенные нами молекулы [2H]и [13С]аминокислот представляли собой консистенции, в каких присутствовали изотопнозамещённые формы молекул, различающиеся количеством атомов водорода и углерода, замещённых на дейтерий и изотоп углерода-13. При всем этом рассредотачивание зависело как от общего включения изотопа в молекулу, так и от метода их получения. Наши исследования проявили, что в критериях ауксотрофности по лейцину уровень изотопного обогащения молекулы лейцина, также метаболически связанных с ним молекул аминокислот малость ниже, чем для других молекул аминокислот, возможно, за счёт сохранения минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом данных аминокислот de novo. При выращивании B. methylicum на среде, содержащей 98% тяжёлую воду и немеченый L-лейцин, уровни включения дейтерия в молекулы личных аминокислот культуральной воды составил 51% для молекулы лейцина/изолейцина, 58,8% для молекулы валина, в то время как уровни изотопного включения для молекулы аланина составили 77,5%, а для молекулы фенилаланина -75%.
Подобная корреляция наблюдается и в молекулах аминокислот белковых гидролизатов. Уровни включения атомов дейтерия и углерода-13 в молекулы метаболически связанных аминокислот в границах схожих концентраций меченых субстратов, нашли определённую коррелляцию: уровни изотопного включения для молекул валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматичных аминокислот) коррелировали. Уровни изотопного включения для молекул глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и лизина (семейство аспарагина) также имели близкие величины.
Принципиальным результатом являются высочайшие уровни включения атомов размеренных изотопов 2Н и 13С в молекулы приобретенных аминокислот. В текущее время исследования по исследованию биотехнологического потенциала метилотрофных микробов для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и других БАС длятся как на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова, так и в ГНИИ ГЕНЕТИКА.
Генно-инженерные способы включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот и белков.
Производить направленное биосинтетическое включение атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот и белков комфортно за счёт использования векторов экспрессии подходящих генов, ответственных за биосинтез того либо другого интересующего исследователей белка. Оправдано и целенаправлено внедрение для этих целей векторов экспрессии на базе плазмидной ДНК бактерии E. coli, к примеру, вектор экспрессии Т4 лизоцима, включающий в собственном составе плазмиду pHSe5 [118]. В итоге использования этого вектора экспрессии, были получены миллиграммовые количества Т4-лизоцима, селективно меченного размеренными изотопами азота-15 ли углерода-13. Включение атомов размеренных изотопов в молекулы достигалось за счет роста генного конструкта E. coli на средах, содержащих [15N]или [13С]аминокислоты. Способ также может применяться для получения личных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, хороших от E. coli, к примеру, системы экспрессии на базе клеток насекомых либо млекопитающих [119].
Другие микробные системы, в каких белки экспрессируются с высочайшими выходами, также могут быть применимы для включения атомов размеренных изотопов в молекулы. К ним относятся такие отлично изученные био объекты, как дрожжи, бактерии и бактериофаги. Так, за счёт использования перечисленных выше микробных объектов в качестве векторов экспрессии были получены препаративные количества личных очищенных [15N]белков: нуклеаза стафилококка [120], интерлейкин 1b [121], белок репрессор фага P22C2 [122], тиредоксин E. coli [123], гемоглобин [124], a-протеаза [125], ингибитор субтилизина [126], репрессор фага l [127], и белок людского фактора роста N-ras P21 [128].
В работе [129] описан способ включения атомов дейтерия в молекулы личных белков с внедрением вектора экспрессии на базе штамма облигатных метилотрофных микробов Methylobacillus flagellatum. Способ заключается в том, что в метилотрофах клонируют структурный ген исследуемого белка. Таким способом можно в дальнейшем получать, к примеру, [2H]b-интерфероны, отлично экспрессируемые в клеточках метилотрофов, или другие интересующие исследователей белки. Способ также позволяет вводить в молекулы аминокислот и белков другие атомы размеренных изотопов, к примеру, изотоп углерода-13. В связи с этим следует выделить, что главным недочетом при использовании приобретенных данным способом [13C]аминокислот в ЯМР-исследованиях являются всё же недостаточно высочайшие уровни изотопного обогащения аминокислот, что обусловливает усложнение спектров ЯМР за счет 12C13C-спин-спинового взаимодействия меж окрестными атомами углерода в молекуле [130]. Потому что мультиквантовые резонансы близкорасположенных атомов углерода в молекуле являются главным препятствием для интерпретации спектров ЯМР, нужно использовать улучшенные способы включения атома изотопа углерода-13 в молекулы аминокислот, дозволяющие лимитировать процесс разбавления изотопной метки. Так, в ближайшее время были на генном уровне сконструированы новые штаммы микробов, которые несут мутации по генам метаболизма определенного круга предшественников этих аминокислот [131]. Это дает возможность избежать разбавления изотопной метки при росте мельчайшего организма на среде, содержащей те либо другие меченые субстраты за счет ингибирования биосинтеза аминокислот de novo у данных мутантных штаммов микробов.
При выборе определенных мутаций по генам метаболизма стремятся удовлетворить как миниум двум условиям для обычного функционирования схожих на генном уровне сконструированных систем, чтоб, во-1-х, по способности понизить деградацию изотопной метки либо ее разбавление в процессе внутриклеточного синтеза немеченых предшественников de novo и во-2-х, свести к минимуму процессы перестройки меченых положений углеродного скелета молекулы за счет биосинтеза схожих интермедиантов, образующихся по сопряжённым путям биосинтеза. Данная стратегия реализована в работе [132], где сообщается о получении 2-ух на генном уровне сконструированных штаммов микробов, обозначенных как E. coli DL10 и E. coli DL11, которые несли геномные делеции, исключающие обмен атомов углерода меж интермедиаторами в процессе гликолиза и в цикле трикарбоновых кислот.
За счёт использования на генном уровне сконструированных штаммов удалось включить атомы изотопа углерода-13 в молекулы аминокислот с уровнями изотопного обогащения до 95%. Ферменты у штамма E. coli DL10 были инактивированы за счёт мутаций, вследствие чего он ассимилировал в качестве источников углерода и энергии сукцинат и ацетат из ростовой среды, а [1-13C]лактат добавляли в ростовую среду для компенсации метаболических потребностей клеточки и для введения атомов изотопа углерода-13 в молекулы аминокислот, синтезируемых в процессе гликолиза.
Другой штамм микробов E. coli DL11 мог утилизировать немеченую глюкозу в качестве источников углерода и энергии по гликолитическому пути ассимиляции углерода, в то время как [1,4-13C]cукцинат и [1-13C]ацетат добавляли в ростовую среду для того, чтоб провоцировать биосинтез [13C]аминокислот, образующихся по циклу трикарбоновых кислот. Не считая того, в данном случае было нужно ввести в бактериальный геном дополнительную мутацию, связанную c геном a-кетоглутаратдегидрогеназы, чтоб минимизировать процесс деградации метки в цикле трикарбоновых кислот.
Выделение изотопномеченых молекул аминокислот из белковых гидролизатов микробов.
Биомасса микробов, выращенных на средах, содержащих постоянные изотопы, является ценным источником разных изотопномеченых БАС, в том числе аминокислот. При всем этом более распространённым и обычным способом препаративного выделения аминокислот из клеточной биомассы является её гидролиз с внедрением ферментативных либо хим способов и следующая ионообменная хроматография на катионои анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.) [133].
Огромное значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того либо другого гидролизирующего агента, который определяется целью исследования. Ферментативное расщепление протеолитическими ферментами может протекать ступенчато с концов молекулы (экзопептидазами) либо оковём расщепления специфичных отдельных пептидных связей полипептидной цепи (эндопептидазами), причём специфика находится в зависимости от конфигурации, аминокислотной последовательности и конформации белка [134]. Для селективного хим расщепления белков создано сильно много способов [135], посреди которых есть некоторое количество способов расщепления по a-углеродному атому (к примеру, через остатки дегидроаланина).
Щёлочи и кислоты владеют высочайшей гидролизующей способностью и потому их внедрение приводит к разрушению неких аминокислот и к изотопному обмену в триптофане, тирозине и гистидине и в неких других аминокислотах. В критериях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH)2 либо NaOH, 24 ч, 1100) реакций изотопного обмена водорода на дейтерий фактически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2’ гистидина) [136]. Значимым недочетом щелочного гидролиза, лимитирующим его внедрение, является значимая рацемизация аминокислот. Потому для препаративных целей щелочной гидролиз употребляется очень изредка, в то время как кислотный — очень обширно.
Кислотный гидролиз в стандартных критериях (6 н. НCl либо 8 н. Н2SO4, 24 ч, 1100), как понятно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и неких других аминокислот [137]. Добавление в обскурантистскую среду оксибензола [138], тиогликолевой кислоты [139], b-меркаптоэтанола [140], позволяет сохранить до 80-85% триптофана. Не считая этого, в критериях кислотного гидролиза с высочайшей скоростью протекает изотопный обмен ароматичных протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина [141], также протонов (дейтеронов) при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [142]. Потому для получения реальных данных о биосинтетическом включении дейтерия в белок рекомендуется проводить кислотный гидролиз в присутствии дейтерированных реагентов. Этим методом могут быть выделены и анализированы с внедрением ионообменной хроматографии большая часть молекул аминокислот в составе гидролизатов белка. С помощью ионообменной хроматографии были препаративно выделены [2H], [13C]и [15N]аминокислоты из белковых гидролизатов различных природных источников с выходами личных аминокислот от 77% до 95% и с уровнями изотопного включения, превосходящими 95% [143].
Способ выделения молекул аминокислот из гидролизатов биомассы, будучи обширно применяем на практике нередко просит использования вредных буферных смесей (ацетат, формиат, пиридин и др.), нескольких колонок с следующей рехроматографией для полного выделения незапятнанных аминокислот из гидролизатов биомассы.
Условия ионообменного разделения молекул дейтерий-меченных аминокислот из гидролизатов суммарных белков биомассы микроводоросли Scenedesmus obliquus, состав элюирующих растворителей, время проведения хроматографического анализа и др, были изучены в работе [144]. Уровни изотопного включения атомов дейтерия в молекулы аминокислот, выделенные из гидролизатов белков Scenedesmus obliquus составили более 98%. Вследствие протекания реакций оборотного изотопного (1Н-2Н)-обмена с протонированным растворителем в процессе элюирования молекул дейтеро-аминокислот с сорбента, протоны в b-положении аспарагиновой кислоты и g-положении глутаминовой кислоты были обогащены атомами дейтерия на 90%, т. е. ниже, чем для других молекул аминокислот. Подвижные атомы дейтерия в a-положении имидазольного кольца молекулы гистидина и атомы дейтерия при гетероатоме азота в индольном кольце триптофана также просто обменивались на протоны в составе аква растворителей при выделении аминокислот.
Молекулы [13C]аминокислот были выделены из гидролизатов суммарных белков биомассы штамма метаногенных микробов Methanobacterium espanolae при росте микробов на [1-13C]и [2-13C]ацетате с уровнями включения атомов изотопа углерода-13 в молекулы аминокислот до 90% [145]. Согласно цитируемым там данным, наименее 2% случайной изотопной метки в молекулах аминокислот были распределены меж атомами углерода в позициях, происходящих из 13С карбоксильной либо метильной группы ацетата и еще наименьший процент включения метки детектировался в положениях углеродного скелета молекул, образованных из 13СО2.
Большой практический энтузиазм представляет реализация преимуществ препаративной обращенно-фазовой высокоэфективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при разделении оптически незапятнанных изотопно-меченых молекул аминокислот и их N-производных в количествах, нужных для биоаналитических и синтетических целей [146, 147]. Так, в работе [147] описан способ препаративного разделения личных молекул аминокислот из разных микробиологических источников при помощи ОФ ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных (N-Cbz производных) аминокислот. Разработанный способ позволяет выделять аминокислоты с высочайшим выходом (от 67% до 89%) и хроматографической чистотой (96-99%) [147] и может быть применен для выделения [2H]-, [13C]-, [15N] и [18O]аминокислот из белковых гидролизатов разных источников.
ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ Способ ВКЛЮЧЕНИЯ АТОМОВ Размеренных ИЗОТОПОВ В МОЛЕКУЛЫ.
Другим подходом по включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот является химико-ферментативный способ, основанный на композиции синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано внедрение препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, также иммобилизованных ферментов.
Ферментативные реакции производят на иммобилизованных ферментах, к примеру, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина [148], иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина [149] и [2H]тирозина [150], триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана [151], глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты [152], аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты [153] и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина [154].
Ферментативный способ употребляется для препаративного лабораторного и промышленного получения оптически активных аминокислот, благодаря высочайшей субстратной специфики ферментов и способности селективного введения размеренных изотопов по определённым положениям молекул аминокислот. Основными качествами использования ферментативных систем являются каталитические реакции ассиметрического образования связи на прохиральных субстратах и ферментативное разделение рацематов аминокислот.
Что касается хроматографического разделения рацематов на прохиральных сорбентах, то оно все таки недостаточно отлично для разделения и обеспечивает в наилучшем случае более половины меченого продукта в виде 1-го из оптических антиподов. Ферментативная стадия нередко завершает хим синтез изотопномеченых аналогов аминокислот, при этом внедрение для этих целей интактных клеток либо их экстрактов так же отлично, как внедрение очищенных ферментов. Но, субстратная специфика ферментов, их ограниченная доступность, сложность их выделения и чистки ограничивают их применение для этих целей. Невзирая на то, что ферментативные синтезы преодолевают все перечисленные выше трудности, низкие выхода очищенных ферментов лимитируют внедрение химико-ферментативных реакций. Так, разработанный ферментативный процесс для включения атомов азота-15 в молекулу аланина включает всеохватывающее внедрение нескольких специфичных ферментов и меченых субстратов и имеет выход по мотивированному продукту менее 1 г [155]. С другой стороны, способы генной инженерии открывают способности для получения большинства ферментных препаратов в препаративных количествах.
Включение изотопа азота-15 в молекулы аминокислот связано с внедрением [15N]аммонийных либо [15N]нитратных солей в качестве источников изотопной 15N-метки [156], в то время как ферментативный способ более эффективен для включения изотопа азота-15 в молекулы [15N]аспарагиновой и [15N]глутаминовой кислот за счёт аминирования a-кетопроизводных аминокислот и в тех случаях, когда нужны высочайшие уровни включения изотопа 15N в молекулы [157].
Воплощение разных способов включения атомов изотопа азота-15 в молекулы аминокислот связано с внедрением способов газовой подпитки 15NН3 [158], иммобилизацией клеток с следующей активацией носителя 15NН4Cl [159], либо с оптимизацией концентраций [15N]предшественников аминокислот в ростовых средах [160]. C внедрением перечисленных выше подходов были получены [15N]аспарагиновая кислота и [15N]аланин с уровнями изотопного включения 15N, превосходящими 95% [161]. При всем этом иммобилизованные клеточки E. coli были применены как источник аспартазы, которая катализирует перевоплощение [15N]фумаровой кислоты и [15N]фумарата в [15N]аспарагиновую кислоту, в то время как для получения [15N]аланина из [15N]аспарагиновой кислоты в качестве источника аспартат-4-декарбоксилазы использовали бактерию Pseudomonas decahee. [15N]глутаминовую кислоту получали за счёт процесса ферментации микробов Brevibacterium lactofermentum с предшественниками аминокислот в присутствии 15NН4ОН [162].
Для включения атомов изотопа углерода 13С в молекулы аминокислот могут применяться подобные ферментативные подходы с применением [13С]глюкозы, но при проведении ферментативной реакции требуются значимые количества высокообогащённой [13C]глюкозы и потому даный способ является очень дорогим для получения [13C]аминокислот. Не считая того, большая часть глюкозы (до 70%) идёт на обеспечение процесса дыхания клеточки, потому эффективность мечения молекул БАС изотопом углерода за счёт ферментативного окисления [13С]глюкозы низкая. Так, уровни изотопного обогащения молекулы [13C]глутамата, приобретенного ферментативно с ролью [13C]глюкозы, были наименее 50% [163].
Перспективны также подходы с внедрением композиции химико-ферментативных и биотехнологических методов включения атомов размеренных изотопов в молекулы аминокислот. В работах [164, 165] сообщается о получении более 10-ка аналогов молекул триптофана, специфично меченных изотопами 2Н, 13C, 15N по индольному кольцу молекулы. Моно-изотопномеченые производные индолов и их 4, 5 и 7-гидроксипроизводные были ферментативно превращены в меченые аналоги триптофана с помощью на генном уровне сконструированного штамма микробов E. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с триптофановым (Тrp) опероном, который кодировал ряд ферментов, ответственных за биосинтез этой аминокислоты.
Невзирая на многочисленность обрисованных в современной литературе подходов по включению атомов размеренных изотопов в молекулы БАС, в текущее время фактически не существует методов, которые позволяют получать аминокислоты и белки, меченные 2Н, 13С, 15N и 18O за счет того либо другого универсального подхода, хотя химико-ферментативные способы позволяют использовать одну и ту же химико-биохимическую реакцию для получения меченых аминокислот за счет внедрения разных меченых низкомолекулярных реагентов (субстратов). Включение атомов размеренных изотопов в молекулы удобнее всего проводить с внедрением биотехнологических подходов, в то время как селективности включения размеренных изотопов в молекулы БАС можно достигнуть за счёт внедрения композиции синтетических и ферментативных реакций. Выбор способа получения молекул БАС, несущих тот либо другой атом изотопа, определяется сначала целью исследования.
Перечень литературы к данной работе смотрите тут.