Получение дейтерий-меченного инозина
Получение дейтерий-меченного инозина
Для получения дейтерий-меченного инозина использовали мутантный штамм B. subtillis (за ранее приспособленный к росту на среде, содержащей наибольшие концентрации 2Н2O оковём рассева), который вследствие нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов продуцирует и выделяет до 20 г инозина на 1 л культуральной воды. Иcследуемый штамм проявлял наивысшую продуктивность по признаку инозинообразования на богатых ферментационных средах, содержащих в качестве источника углерода и энергии глюкозу (10-12 % от веса), а в качестве источника ростовых причин и дополнительного источника азота белково-витаминный концентрат (БВК) дрожжей. Ввиду высочайшей цены дейтерий-меченных субстратов, и их малой доступности, было нужно отыскать более подходящий природный источник, из которого их можно просто выделять. В качестве такого использовали факультативные метилотрофные бактериии B. methylicum, которые очень комфортны для выработки высокодейтерированных БАС [см. к примеру 8, 9]. Данный штамм метилотрофных микробов, характеризовался устойчивым ростом и высочайшими выходами биомассы на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н (см. диаграмму). Вот поэтому мы использовали гидролизаты его биомассы для культивирования штамма продуцента инозина.
При разработке рецептуры питательной среды учитывалось, что метилотрофные бактерии при росте на метаноле способны синтезировать огромное количество всеполноценных белков (до 50% веса сухого вещества) [14], также некое количество полисахаридов (до 10%) [15], при этом эта способность сохраняется при росте на средах, содержащих томную воду и дейтеро-метанол. Так как продуцент инозина является полиауксотрофным штаммом, нуждающимся для роста в тирозине, гистидине и аденине, было нужно получать их из гидролизатов биомассы метилотрофных микробов. Для этого проводили два способа гидролиза биомассы: 1. автоклавирование биомассы метилотрофных микробов в 0,5 н. растворе 2НCl (в 2Н2O) (30 мин, 08 ати). 2. гидролиз биомассы в 6 н. 2НCl (в 2Н2O) (24 часа, 110 0С). В подготовительных опытах было показано, что по-первому варианту гидролиза биомассы реализуется еще большая питательность суспензии метилотрофных микробов по-сравнению с гидролизом в 6 н. 2Н2Сl. Потому мы дали предпочтение этому способу проведения гидролиза биомассы.
Количественный и высококачественный состав аминокислот биомассы метилотрофных микробов B. methylicum, также степени дейтерированности аминокислот показаны в таблице. Как видно из данных таблицы, показателем, позволяющим возлагать на высшую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит наибольший уровень дейтерированности аминокислот суммарного белка этих микробов.
ТАБЛИЦА.
Аминокислотный состав метилотрофных микробов B. methylicum, приобретенных в стопроцентно дейтерированной среде dM9 и их уровни дейтерированности.
Аминокислота
Содержание в белке, %
Уровни дейтерированости, %
Глицин
9,69
90,0
Аланин
13,98
97,5
Валин
3,74
50,0
Лейцин
7,33
49,0
изолейцин
3,64
49,0
фенилаланин
3,94
95,0
Тирозин
1,82
92,8
Серин
4,90
86,6
треонин
5,51
не определяли
метионин
2,25
не определяли
аспарагиновая кислота
9,59
66,6
глутаминовая кислота
10,38
70,0
Лизин
3,98
58,9
Аргигин
5,27
не определяли
гистидин
3,72
не определяли
Экспериментально разработанный метод получения дейтерий-меченного инозина представлен на схеме. Его главные этапы: наработка дейтерированной биомассы метилотрофных микробов B. methylicum методом культивирования микробов в стопроцентно дейтерированной среде dM9; выделение фракции общих белков биомассы и их гидролиз; ферментация базисного штамма B. subtilis на среде, приготовленной на базе 99,9 ат% 2Н2О и гидролизатов биомассы метилотрофных микробов; выделение инозина, включая его адсорбцию активированным углем, десорбцию спиртово-аммиачным (1:1) веществом и следующую кристаллизацию инозина из метанола. Чистоту приобретенного инозина контролировали способом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя в качестве сопоставления хроматографически незапятнанные эталоны нуклеозидов. ТСХ инозина, выделенного из культуральной воды, показала наличие в анализируемом образчике единственного пятна с Rf = 0,51, соответственного по подвижности чистому инозину.