Способ твердофазовой адаптации клеток к тяжёлой воде
Способ твердофазовой адаптации клеток к тяжёлой воде
К.х.н. О.В. Мосин
Способ ТВЕРДОФАЗОВОЙ АДАПТАЦИИ КЛЕТОК К ТЯЖЁЛОЙ ВОДЕ
Тяжёлая вода отличается от обыкновенной воды молекулярной массой. В молекуле тяжёлой воды в отличие от обыкновенной воды заместо 2-ух атомов водорода, связанных ковалентной связью с атомом кислорода в молекуле эти два атома водорода замещены на дейтерий.
Атом дейтерия отличается от атома водорода тем, что не считая протона он содержит нейтрон. Различие в нуклеарной массе атомов водорода и дейтерия и определяет те гидрофобные эффекты, которые тяжёлая вода оказывает на клеточки и организм.
Принципиальной неувязкой для биосинтеза является адаптация клеточки к тяжёлой воде. Длительное время числилось, что тяжёлая вода несовместима с жизнью. Понятно, что высочайшие концентрации тяжёлой воды в ростовой среде могут вызвать ингибирование жизненно-важных функций роста и развития многих микробов [1].
Но, невзирая на нехороший биостатический эффект, оказываемый тяжёлой водой на клеточки, некие бактерии устойчивы к высочайшим концентрациям тяжёлой воды в среде [2], в то время как растительные клеточки могут нормально развиваться при концентрациях менее 50-75% тяжёлой воды [3], а клеточки животных менее 35% тяжёлой воды [4].
Мы задались вопросом — каковой механизм клеточной адаптации к тяжёлой воде и могут ли клеточки быть удачно приспособлены к росту и биосинтезу на средах с наивысшими концентрациями тяжёлой воды?
Для решения этого вопроса мы избрали для тестов бактериальные штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, относящиеся к разным таксономическим родам микробов, приобретенных из Всероссийской коллекции промышленных микробов (ВКПМ) Муниципального научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микробов:
1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм факультативных метилотрофных микробов, продуцент фенилаланина.
2. Methylobacillus flagellatum КТ, изолейцинзависимый штамм облигатных метилотрофных микробов, продуцент лейцина.
3. Bacillus subtilis В-3157, полиауксотрофный по гистидину, тирозину, аденину и урацилу бациллярный штамм грамотрицательных микробов, продуцент инозина.
4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм галофильных микробов, способный синтезировать бактериородопсин.
Стартовым материалом для культивирования галофильных микробов и бацилл служила дейтеро-биомасса метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum, приобретенная в критериях многостадийной адаптации на жестких агаризованных средах (2% агар) с 2% дейтеро-метанолом, содержащих ступенчато увеличивающийся градиент концентрации тяжёлой воды (от 0 до 98% тяжёлой воды).
Полученную таким макаром дейтеро-биомассу B. methylicum (выход составил 100 г по мокроватому весу с 1 л. среды) автоклавировали в 0.5 н. растворе дейтерохлорной кислоты (в тяжёлой воде) (08 ати, 30 мин), нейтрализовали 0.1 н. КОН (рН 7.0) и использовали дальше в качестве источника субстрата для адаптации и культивирования бацилл и галофильных микробов.
Культивировании клеток микробов проводили на трёх питательных средах (количества компонент приведены в г/л):
1. Малая среда М9 для роста метилотрофных микробов, на базе разных концентраций тяжёлой воды и добавками 0.5-2% метанола (зависимо от физиологической потребности микробов) либо дейтеро-метанола: KH2PO4 3; Na2HPO4 6; NaCl 0.5; NH4Cl 1.
2. Гидролизная среда 1 (ГС1) для культивирования бацилл (на базе 99.9% тяжёлой воды): глюкоза 120; дейтеро-меченая биомасса B. methylicum 25; NH4NO3 30; MgSO4 x 7H2O 20; мел 20.
3. Гидролизная среда 2 (ГС2) для культивирования галофильных микробов (на базе 99.9% тяжёлой воды): NaCl 250; MgSO4 x 7H2O 20; KCl 2; CaCl2 x 6H2O 0.065; цитрат натрия 0.5; дейтеро-меченая биомасса B. methylicum 20.
Культивирование метилотрофных микробов и бацилл проводили при 370 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с заполнением средой до 50 мл в критериях аэрации по методикам [5-8], используя в качестве источников дейтерия тяжёлую воду и дейтеро-метанол. Культивирование галофильных микробов проводили на тяжеловодородной среде при освещении лампами дневного света ЛБ-40.
Для проведения адаптации был избран ступенчатый режим роста концентрации тяжёлой воды в ростовых средах в присутствии 0.5-1%-ного метанола/дейтеро-метанола , потому что мы представили, что постепенное привыкание организма к дейтерию будет оказывать подходящий эффект на характеристики роста и общее самочувствие клеток.
Предложенный нами способ твёрдофазной адаптации состоит из серии множественных адаптационных пассажей начальной культуры на чашечках Петри с твёрдыми агаризованными средами со ступенчатом увеличении концентрации тяжёлой воды в их (от 0 до 98% тяжёлой воды).
При всем этом на чашечках Петри поочередно отбирались отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих низкие концентрации тяжёлой воды. Потом их пересевали на среды с большей степенью дейтерированности, включая среду с 98% тяжёлой водой (степень выживаемости микробов на наибольшей тяжёловодородной среде составила менее 50%).
За ходом адаптации клеток следили по изменениям длительности лаг-фазы, времени клеточной генерации и выходов микробной биомассы, также по наибольшему уровню скопления конечных товаров биосинтеза в культуральной воды. Рост микробов оценивали по возможности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред, также по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм.
1-ые опыты по адаптации клеток к тяжёлой воде привели к беде. Штамм M. flagellatum нашел завышенную чувствительность к тяжёлой воде: ингибирование скорости роста микробов наблюдалось при концентрации тяжёлой воды в среде 74.5%, в то время как дейтеро-метанол не оказывал существенного воздействия на скорость роста клеток. Так, на среде, содержащей 74.5% тяжёлую воду выход микробной биомассы составил 29%, что в 3.4 раза ниже, чем в контрольных опытах, когда использовали обыденную воду и метанол, в то время как выход микробной биомассы на аква среде с 1%-ным дейтеро-метанолом был снижен всего только в 1.2 раза.
Пробы адаптировать другой штамм B. methylicum к росту на тяжёлой воде при сохранении возможности к биосинтезу фенилаланина привели к хорошему результату. При росте клеток B. methylicum на обыкновенной воде длительность лаг-фазы не превосходила 20 ч, в то время как с повышением концентрации тяжёлой воды в ростовых средах до 98% длительность лаг-фазы увеличивалась до 60 часов.
Мы нашли, что продолжительность времени клеточной генерации с повышением концентрации тяжёлой воды в ростовых средах равномерно возрастает, достигая 4,9 часов на среде с 98% тяжёлой воды и 2% дейтеро-метанолом. В отличие от тяжёлой воды, дейтеро-метанол не вызывал ингибирования роста и не оказывал воздействия на выходе микробной биомассы. Напротив, на очень концентрированной тяжёлой воде водой выход микробной биомассы был снижен в 3.3 раза по сопоставлению с контролем.
Принципиально то, что выход микробной биомассы и уровень скопления фенилаланина в культуральной воды при росте приспособленного к тяжёлой воде мельчайшего организма в очень концентрированной тяжёлой воде меняются по сопоставлению с контрольными критериями на 13 и 5%, т. е. некординально.
В последующих опытах была изучена способность к росту на тяжёлой воде бациллярного штамма B. subtilis, продуцента инозина. Рост данного штамма идеальнее всего происходил на ГС 1 среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, а в качестве источника ростовых причин гидролизаты дейтерий-меченой биомассы метилотрофных микробов B. methylicum.
Данный штамм удалось адаптировать к тяжёлой воде оковём рассева на твёрдую агаризованную среду ГС 1 с 99.9% тяжёлой воды. Он сходу нашел обычный рост на тяжёлой воде.
При культивировании приспособленного B. subtilis на водянистой ГС 1 среде, уровень скопления инозина в культуральной воды понижается по-сравнению с начальным штаммом.
При росте начального штамма B. subtilis на среде, содержащей обыденную воду и протонированную биомассу уровень скопления инозина в культуральной воды достигал величины 17 г/л после 5 суток культивирования. Совместно с тем уровень скопления инозина на ГС 1 среде, был снижен в 4.4 раза по сопоставлению с начальным штаммом на протонированной среде.
Сниженный уровень продукции инозина на в этих критериях коррелирует со степенью конверсии глюкозы, которая на тяжёлой воде ассимилировалась не стопроцентно, о чём свидетельствовали значимые количества скопленной в культуральной воды глюкозы после ферментации.
В случае с галофильной бактерией H. halobium адаптацию проводили как на агаре, содержащим 99.9% тяжёлую воду с добавлением гидролизатов дейтеро-меченой биомассы B. methylicum, оковём рассева штамма до отдельных колоний, так и на водянистой ГС 2 среде. В обыденных для этой культуры критериях культивирования (37 0С, на свету) в клеточках синтезировался фиолетовый пигмент по всем чертам не отличающийся от нативного мембранного белка бактериородопсина.
Проведённые нами исследования свидетельствуют, что способность к адаптации к тяжёлой воде у различных родов и видов микробов разная и может разнообразить на примере метилотрофных микробов в границах даже одной таксономической группы. Из этого можно заключить, что адаптация к тяжёлой воде определяется как таксономической спецификой микрооорганизмов, так и особенностями их метаболизма, функционированием разных путей ассимиляции субстратов, также эволюционной нисшей, которую занимает исследуемый объект.
При всем этом чем ниже уровень эволюционного развития организма, тем лучше он адаптируется к присутствию дейтерия в среде. Так, из изученных объектов самыми простыми в эволюционном плане являются галофильные бактерии, относящиеся к археобактериям, фактически не нуждающие в адаптации к тяжёлой воде, чего нельзя сказать о метилотрофных микробах, которые сложнее приспосабливаются к тяжёлой воде. Для всех изученных микробов рост на тяжёлой воде сопровождался понижением ростовых черт также уровня продукции секретируемых БАС.
Приобретенные для изученных микробов данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к тяжёлой воде является фенотипическим явлением, так как приспособленные к тяжеленной воде клеточки ворачиваются к нормальному росту и биосинтезу в протонированных средах после некого лаг-периода.
По-видимому, метаболизм приспособленных клеток не претерпевает существенных конфигураций в тяжёлой воде. В то же время эффект обратимости роста на водно/тяжёловодородных средах на теоретическом уровне не исключает способности того, что этот признак размеренно сохраняется при росте в воде, но маскируется при переносе клеток на тяжёлую воду. Но, тут следует отметить, что для проведения адаптации играет немаловажную роль состав среды культивирования.
При всем этом не исключено, что при проведении адаптации на малых средах, содержащих тяжёлую воду образуются формы микробов, ауксотрофные по определенным ростовым факторам, к примеру аминокислотам, и вследствие этого бактериальный рост ингибируется. Адаптация к тяжёлой воде происходит идеальнее всего конкретно на всеохватывающих средах, содержащих широкий набор ростовых причин и аминокислот, компенсирующих потребность микробов в этих соединениях.
Можно представить, что клеточка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые содействуют многофункциональной реорганизации работы жизненно-важных систем в тяжёлой воде. Так, к примеру, нормальному биосинтезу и функционированию в тяжёлой воде таких на биологическом уровне активных соединений, как нуклеиновые кислоты и белки содействует поддержание их структуры средством формирования водородных (дейтериевых) связей в молекулах.
Связи, сформированные атомами дейтерия различаются по прочности и энергии от подобных водородных связей. Различия в нуклеарной массе атома водорода и дейтерия косвенно могут служить предпосылкой различий в синтезах нуклеиновых кислот, которые могут приводить в свою очередь к структурным различиям и, как следует, к многофункциональным изменениям в клеточке. Скорее всего, что ферментативные функции и структура синтезируемых белков также меняются при росте клеток на тяжёлой воде, что может отразиться на процессах метаболизма и деления клеточки.
Некие исследователи докладывают, что после оборотного изотопного (1Н-2H)-обмена ферменты не прекращают собственной функции, но конфигурации в итоге изотопного замещения за счет первичного и вторичного изотопных эффектов, также действие тяжёлой воды как растворителя (большая структурированность и вязкость по сопоставлению с обыкновенной водой) приводили к изменению скоростей и специфики ферментативных реакций в тяжёлой воде.
Структурно-динамические характеристики клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от высококачественного и количественного состава липидов, также могут изменяться в присутствии тяжёлой воды. Приобретенный итог разъясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клеточки, которая испытывает воздействие тяжёлой воды, и тем компенсирует реалогические характеристики мембраны (вязкость, текучесть, структурированность) конфигурацией количественного состава липидов.
В общих чертах, при попадании клеточки в дейтерированную среду из неё не только лишь исчезает протонированная вода за счет реакции обмена вода-тяжёлая вода, да и происходит очень резвый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара.
Понятно, что в этих критериях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-D могут синтезироваться de novo.
Не считая вышеобозначенных эффектов, вероятное изменение соотношения главных метаболитов в процессе адаптации к тяжеленной воде также может плохо сказываться на рост клеточки. Мы представили, что эффекты, наблюдаемые при адаптации к тяжёлой воде связаны с образованием в тяжёлой воде конформаций молекул с другими структурно-динамическими качествами, чем конформаций, образованных с ролью водорода, и потому имеющих другую активность и био характеристики.
Так, по теории абсолютных скоростей разрыв СH-связей может происходить резвее, чем СD-связей, подвижность иона D+ меньше, чем подвижность Н+, константа ионизации тяжёлой воды несколько меньше константы ионизации обыкновенной воды.
Суммируя приобретенные данные, мы пришли к выводу, что чувствительности разных клеточных систем к тяжёлой воде отличны. С физиологической точки зрения, более чувствительными к подмене Н+ на D+ возможно окажутся аппарат биосинтеза макромолекул и дыхательная цепь, т. е., конкретно те клеточные системы, которые употребляют высшую подвижность протонов и высшую скорость разрыва водородных связей.
Нам представляется выбор микробов в качестве модельных объектов для данных исследовательских работ более целесообразным, потому что прокариоты как организмы, стоящие на более низких ступенях развития живого, более лабильны в генетическом нюансе и тем резвее реагируют и адаптируются к изменчивым факторам среды.
Перечень литературы:
1. Crespi H. L. Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. in: Synt. and Appl. of Isot. Label. Compd. // Ed. R. R. Muccino. — Elsevier. — Amsterdam, 1986 — P. 111-112.
2. Katz J, Crespi H.L. // Pure Appl. Chem. — 1972. — V.32. — P. 221-250.
3. Daboll H. F., Crespi H. L., Katz J. J. // Biotechnology and Bioengineering. — 1962. — V. 4. — P. 281-297.
4. Crespy H. L. Stable Isotopes in the Life Sciences. — International atomic energy agency. — Vienna. — 1977. — P. 111-121.
5. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. — 1993. — N 9. — С. 16-20.
6. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. — 1996. — N 3. — С. 3-12.
7. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. // Биоорганическая химия. — 1996. — Т. 22. — N 10-11. — С. 856-869.
8. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Ерёмин С. В., Швец В. И. // Биотехнология. — 1996. — N 5. — С. 25-34.