Выделение изотопно-меченных аминокислот из культуральной воды и гидролизатов биомассы метилотрофных микробов
Выделение изотопно-меченных аминокислот из культуральной воды и гидролизатов биомассы метилотрофных микробов
В процессе выполнения работы было проведено препаративное разделение аминокислот культуральной воды и гидролизатов биомассы метилотрофных микробов способами обращенно-фазовой ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных аминокислот. Так, дейтерий-меченный фенилаланин был выделен из культуральной воды В. methylicum способом обращённо-фазовой ВЭЖХ в виде Z-производного с хроматографической чистотой 99% и выходом 89%. Хроматографически незапятнанные 2Н-и 13С-аминокислоты были выделены из гидролизатов биомассы B. methylicum и M. flagellatum в виде их Z-производных в миллиграммовых количествах [8]. Отдельные аминокислоты: фенилаланин и лейцин были также хроматографически выделены из культуральных жидкостей данных штаммов метилотрофных микробов в виде метиловых эфиров дансил-аминокислот.
Ионнообменная хроматография аминокислот на колонке “Dowex” отлично зарекомендовал себя как аналитический способ для исследования высококачественного и количественного состава белковых гидролизатов метилотрофных микробов. Хроматограмма гидролизата суммарных белков B. methylicum, приобретенных при росте микробов на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н представлена на рис. 3. Как видно из рис.3, в этом гидролизате находятся 16 аминокислот. Так как пролин не детектируется в данных критериях его определяли при длине волны 440 нм.
Таким макаром, проведённые исследования подтвердили эффективность использования метилотрофных микробов для получения 2Н-и 13Саминокислот. Предложенный подход подразумевает всеохватывающее внедрение метилотрофных микробов, позволяя выделять аминокислоты как из культуральной воды после ферментации штаммов продуцентов, так и из гидролизатов суммарных белков биомассы.
ЛИТЕРАТУРА.
1. Patel G.B., Sprott G.D., Ekiel I. // Appl. Environ. Microbiol. — 1993. — V. 59. — N. 4. — P. 1099-1103.
2. John Colby, Howard Dalton. // Ann. Rev. Microbiol. — 1979. — V. 33. — P. 481-517.
3. Skladnev D.A., Baev M.V., Shilova S.Yu., et al. // Proceedings of 6th Europ. Conf. on Biomass for Energy. — Industry and Environment. — Athens. — 1991. — P. 47-51.
4. Katz J., and Crespi H. L. // Pure Appl. Chem. — 1972. — V. 32. — P. 221-250.
5. Crespi H. L. // Biosynthesis and uses of per-deuterated proteins. in: Synthesis and Applications of Isotopically labeled Compounds, Proceedings of the Second Inter. Symp. — Elsevier. — 1986. — P. 111-112.
6. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. — 1994. — V. 6. — P. 165-176.
7. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б.,Складнев Д.А., Акимова О.Л. // Биотехнология. — 1993. — N. 9. — С. 16-20.
8. Егорова Т.А., Мосин О.В., Еремин С.В., Карнаухова Е.Н.,Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биотехнология. — 1993. — N. 8. — С. 21-25.
9. Karnaukhova E.N., Mosin O.V., Reshetova O.S. // Amino Acids. — 1993. — V. 5. — P. 125.
10. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич А.М., Швец В.И. // Биотехнология. — 1996. — N. 3. (в печати).
11. Миллер Дж. Опыты в молекулярной генетике. — М.: Мир, — 1976. — С. 393.
12. Звонкова Е.Н., Зотчик Н.В., Филлипович Е.И., Митрофанова Т.К., Мягкова Г.И., Серебренникова Г.А // Химия на биологическом уровне активных природных соединений. — М.: Химия, 1970. — С. 65-68.
13. Bligh E.G., Dyer W.J. // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — V. 37. — N. 8. — P. 911-918.
14. Егорова Т.А., Ерёмин С.В., Митснер Б.И., Звонкова Е.Н., Швец В.И. // Биотехнология. — N5. — 1993. — С. 30-35.
15. Egorova T.A., Eremin S.V., Mitsner B.I., Zvonkova E.N., Shvets V.I. // J. of Chromatography B. — 1995. — V. 665. — P. 53-62.
16. Daniely B. et al. // J. Org. mass spectrometry. — 1989. — 24. — P. 225-229.
О.V. MOSIN
Moscow State Academy of Fine Chemical Technology named after M.V. Lomonosov, 117571.
METHYLOTROPHIC BACTERIA — AS THE SOURCES OF ISOTOPICALLY LABELED 2H — AND 13CAMINO ACIDS.
A possibility of using the various strains of methylotrophic bacteria for the preparation of amino acids labeled with stable isotopes 2Н и 13С, both secreted into culture medium and obtaining from protein hydrolysates is investigated. The data on adaptaition of L-phynylalanine producing strain of facultative methylotrophic bacteria Brevibacterium methylicum to growth media containing 2 v/v.% С2Н3О2Н and 98 v/v.% 2Н2О and biosynthesis of L-phenylalanine are presented. For L-leucine producing strain of obligate methylotrophic bacteria Methylobacillus flagellatum the cultivation was carried out on a medium containing the ordinary water and 1 v/v.% 13С1Н3ОН. The levels of 2Нand 13С incorporation in amino acids were studied using the electron impact mass-spectrometry method of methyl esters of dansyl -and carbobenzoxychloride — derivatives of amino acids. The levels of 2Нand 13C incorporation into amino acids while growing of methylotrophic bacteria on media containing 2 v/v CH3OH and 98 v/v.% 2Н2O, and 1 v/v.% 13CH3OH and 99 v/v. H2O were found to vary from 97,5% to 95%.