Выделение изотопномеченых аминокислот из белковых гидролизатов микробов
Выделение изотопномеченых аминокислот из белковых гидролизатов микробов
Биомасса микробов, выращенных на средах, содержащих постоянные изотопы, является ценным источником разных изотопномеченых БАС, в том числе аминокислот. При всем этом более распространённым и обычным способом препаративного выделения аминокислот из клеточной биомассы является её гидролиз с внедрением ферментативных либо хим способов и следующая ионообменная хроматография на катионои анионообменных смолах (дауэкс, амберлит, пермутит, аминекс, дуолит и др.) [133]. Огромное значение при проведении гидролиза белка имеет выбор того либо другого гидролизирующего агента, который определяется целью исследования.
Ферментативное расщепление протеолитическими ферментами может протекать ступенчато с концов молекулы (экзопептидазами) либо оковём расщепления специфичных отдельных пептидных связей полипептидной цепи (эндопептидазами), причём специфика находится в зависимости от конфигурации, аминокислотной последовательности и конформации белка [134]. Для селективного хим расщепления белков создано сильно много способов [135], посреди которых есть некоторое количество способов расщепления по ?-углеродному атому (к примеру, через остатки дегидроаланина). Щёлочи и кислоты владеют высочайшей гидролизующей способностью и потому их внедрение приводит к разрушению неких аминокислот и к изотопному обмену в триптофане, тирозине и гистидине и в неких других аминокислотах.
В критериях щелочного гидролиза (4 н. Ba(OH)2 либо NaOH, 24 ч, 1100) реакций изотопного обмена водорода на дейтерий фактически не наблюдается (исключением является протон (дейтерон) у атома С2’ гистидина) [136].
Значимым недочетом щелочного гидролиза, лимитирующим его внедрение, является значимая рацемизация аминокислот. Потому для препаративных целей щелочной гидролиз употребляется очень изредка, в то время как кислотный — очень обширно. Кислотный гидролиз в стандартных критериях (6 н. НCl либо 8 н. Н2SO4, 24 ч, 1100), как понятно, приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и неких других аминокислот [137]. Добавление в обскурантистскую среду оксибензола [138], тиогликолевой кислоты [139], ?-меркаптоэтанола [140], позволяет сохранить до 80-85% триптофана. Не считая этого, в критериях кислотного гидролиза с высочайшей скоростью протекает изотопный обмен ароматичных протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина [141], также протонов (дейтеронов) при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [142]. Потому для получения реальных данных о биосинтетическом включении дейтерия в белок рекомендуется проводить кислотный гидролиз в присутствии дейтерированных реагентов. Этим методом могут быть выделены и анализированы с внедрением ионообменной хроматографии большая часть аминокислот в составе гидролизатов белка (рис. 3). Так, с помощью ионообменной хроматографии были препаративно выделены [2H], [13C]и [15N]аминокислоты из белковых гидролизатов различных природных источников с выходами личных аминокислот от 77% до 95% и с уровнями изотопного включения, превосходящими 95% [143]. Но, способ выделения аминокислот из гидролизатов биомассы, будучи обширно применяем на практике нередко просит использования вредных буферных смесей (ацетат, формиат, пиридин и др.), нескольких колонок с следующей рехроматографией для полного выделения незапятнанных аминокислот из гидролизатов биомассы.
Условия ионообменного выделения [2H]аминокислот из гидролизатов суммарных белков биомассы микроводоросли Scenedesmus obliquus, состав элюирующих растворителей, время проведения хроматографического анализа и др, были изучены в работе [144]. При всем этом, уровни изотопного включения дейтерия в аминокислоты, выделенные из гидролизатов белков Scenedesmus obliquus составили более 98%. Вследствие протекания реакций оборотного изотопного (1Н-2Н)-обмена с протонированным растворителем в процессе элюирования [2H]аминокислот с сорбента, протоны в ?-положении аспарагиновой кислоты и ?-положении глутаминовой кислоты были обогащены дейтерием на 90%, т. е. ниже, чем для других аминокислот. Подвижные атомы дейтерия в ?-положении имидазольного кольца молекулы гистидина и атомы дейтерия при гетероатоме азота в индольном кольце триптофана также просто обменивались на протоны в составе аква растворителей при выделении аминокислот.
[13C]аминокислоты были выделены из гидролизатов суммарных белков биомассы штамма метаногенных микробов Methanobacterium espanolae при росте микробов на [1-13C]и [2-13C]ацетате с уровнями включения 13С в молекулы аминокислот до 90% [145]. Согласно цитируемым там данным, наименее 2% случайной метки в молекулах аминокислот были распределены меж атомами углерода в позициях, происходящих из 13С карбоксильной либо метильной группы ацетата и еще наименьший процент включения метки детектировался в положениях углеродного скелета молекул, образованных из 13СО2.
Большой практический энтузиазм представляет реализация преимуществ препаративной обращенно-фазовой высокоэфективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при получении оптически незапятнанных меченых аминокислот и их N-производных в количествах, нужных для биоаналитических и синтетических целей [146, 147]. Так, в работе [147] описан способ препаративного выделения личных аминокислот из разных микробиологических источников при помощи ОФ ВЭЖХ в виде бензилоксикарбонильных производных (N-Cbz производных) аминокислот. Разработанный способ позволяет выделять аминокислоты с высочайшим выходом (от 67% до 89%) и хроматографической чистотой (96-99%) [147] и может быть применен для выделения [2H]-, [13C]-, [15N] и [18O]аминокислот из белковых гидролизатов разных источников.