Химико-ферментативный способ
Химико-ферментативный способ
ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ Способ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОТОПНОМЕЧЕНЫХ АМИНОКИСЛОТ И БЕЛКОВ
Другим подходом по получению изотопномеченых аминокислот является химико-ферментативный способ, основанный на композиции синтетических и ферментативных реакций. Для этого перспективно и экономически оправдано внедрение препаратов очищенных ферментов и их экстрактов, безклеточных ферментативных систем, также иммобилизованных ферментов. Ферментативные реакции производят на иммобилизованных ферментах, к примеру, таких как аланиндегидрогеназе (КФ 1.4.1.1) в присутствии NADH при получении [2H]аланина [148], иммобилизованной на сахарозе фенилаланинаммонийлиазе (КФ 4.3.1.5) и фенилаланингидроксилазе (КФ 1.14.16.1), при получении [2H]фенилаланина [149] и [2H]тирозина [150], триптофансинтазе (КФ 4.2.1.20), при получении [2H]триптофана [151], глутаматдегидрогеназе (КФ 1.4.1.2), при получении [2H]глутаминовой кислоты [152], аспартазы (КФ 4.3.1.1), при получении [2Н]аспарагиновой кислоты [153] и серингидроксиметилазе (КФ 2.5.1.6) при получении [2H]серина [154].
Ферментативный способ издавна употребляется для препаративного лабораторного и промышленного получения оптически активных аминокислот, благодаря высочайшей субстратной специфики ферментов и способности селективного введения размеренных изотопов по определённым положениям молекул аминокислот. Основными качествами использования ферментативных систем являются каталитические реакции ассиметрического образования связи на прохиральных субстратах и ферментативное разделение рацематов аминокислот.
Что касается хроматографического разделения рацематов на прохиральных сорбентах, то оно все таки недостаточно отлично для разделения и обеспечивает в наилучшем случае более половины меченого продукта в виде 1-го из оптических антиподов. Ферментативная стадия нередко завершает хим синтез меченых аналогов аминокислот, при этом внедрение для этих целей интактных клеток либо их экстрактов так же отлично, как внедрение очищенных ферментов. Но, субстратная специфика ферментов, их ограниченная доступность, сложность их выделения и чистки ограничивают их применение для этих целей. Невзирая на то, что ферментативные синтезы преодолевают все перечисленные выше трудности, низкие выхода очищенных ферментов лимитируют внедрение химико-ферментативных реакций. Так, разработанный ферментативный процесс для получения [15N]аланина включает всеохватывающее внедрение нескольких специфичных ферментов и меченых субстратов и имеет выход по мотивированному продукту менее 1 г [155]. С другой стороны, способы генной инженерии открывают способности для получения большинства ферментных препаратов в препаративных количествах.
Способы получения [15N]аминокислот связаны с внедрением [15N]аммонийных либо [15N]нитратных солей в качестве источников 15N-метки [156], в то время как ферментативный способ более эффективен для получения сначала [15N]аспарагиновой и [15N]глутаминовой кислот за счёт аминирования ?-кетопроизводных аминокислот и в тех случаях, когда нужны высочайшие уровни включения изотопа 15N в молекулы [157].
Воплощение разных способов включения 15N-метки в молекулы аминокислот связано с внедрением способов газовой подпитки 15NН3 [158], иммобилизацией клеток с следующей активацией носителя 15NН4Cl [159], либо с оптимизацией концентраций [15N]предшественников аминокислот в ростовых средах [160]. C внедрением перечисленных выше подходов были получены [15N]аспарагиновая кислота и [15N]аланин с уровнями изотопного включения 15N, превосходящими 95% [161]. При всем этом иммобилизованные клеточки E. coli были применены как источник аспартазы, которая катализирует перевоплощение [15N]фумаровой кислоты и [15N]фумарата в [15N]аспарагиновую кислоту, в то время как для получения [15N]аланина из [15N]аспарагиновой кислоты в качестве источника аспартат-4-декарбоксилазы использовали бактерию Pseudomonas decahee. [15N]глутаминовую кислоту получали за счёт процесса ферментации микробов Brevibacterium lactofermentum с предшественниками аминокислот в присутствии 15NН4ОН [162].
Для включения изотопа 13С в молекулы аминокислот могут применяться подобные ферментативные подходы с применением [13С]глюкозы, но при проведении ферментативной реакции требуются значимые количества высокообогащённой [13C]глюкозы и потому даный способ является очень дорогим для получения [13C]аминокислот. Не считая того, большая часть глюкозы (до 70%) идёт на обеспечение процесса дыхания клеточки, потому эффективность мечения молекул БАС изотопом углерода за счёт ферментативного окисления [13С]глюкозы низкая. Так, уровни изотопного обогащения [13C]глутамата, приобретенного ферментативно с ролью [13C]глюкозы, были наименее 50% [163].
Перспективны также подходы с внедрением композиции химико-ферментативных и биотехнологических методов получения изотопномеченых аминокислот. В работах [164, 165] сообщается о получении более 10-ка аналогов триптофана, специфично меченных изотопами 2Н, 13C, 15N по индольному кольцу молекулы. Моно-изотопномеченые производные индолов и их 4, 5 и 7-гидроксипроизводные были ферментативно превращены в меченые аналоги триптофана с помощью на генном уровне сконструированного штамма микробов E. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с триптофановым (Тrp) опероном, который кодировал ряд ферментов, ответственных за биосинтез этой аминокислоты.
В заключение необходимо подчеркнуть, что невзирая на многочисленность обрисованных в современной литературе подходов по получению БАС, меченных размеренными изотопами, в текущее время фактически не существует методов, которые позволяют получать аминокислоты и белки, меченные 2Н, 13С, 15N и 18O за счет того либо другого универсального подхода, хотя химико-ферментативные способы позволяют использовать одну и ту же химико-биохимическую реакцию для получения меченых аминокислот за счет внедрения разных меченых низкомолекулярных реагентов (субстратов). Получение аминокислот и белков, высокообогащённых размеренными изотопами удобнее всего проводить с внедрением биотехнологических подходов, в то время как селективности включения размеренных изотопов в молекулы БАС можно достигнуть за счёт внедрения композиции синтетических и ферментативных реакций. Выбор способа получения БАС, несущих ту либо иную изотопную метку, определяется сначала целью исследования.