Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum к тяжеленной воде
Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum к тяжеленной воде
БИОТЕХНОЛОГИЯ
О. В. МОСИН
Столичная муниципальная академия узкой хим технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, 86.
Разработан способ физиологической адаптации нового фенилаланин-продуцирующего RuMP штамма факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum к наибольшим (98 об.%) концентрациям 2Н2О с целью следующего микробиологического синтеза 2Н-меченого фенилаланина. Способ заключается в последовательом рассеве штамма на агаризованных средах М9 с 2 об.% [U -2Н]MetOH со ступенчато растущим градиентом концентрации 2Н2O (от 0 до 98 об.% 2Н2О) и следующей селекцией колоний по признаку стойкости к 2Н2О. В итоге внедрения разработанного подхода для данного штамма метилотрофных микробов на среде с 98 об.% 2H2О были отобраны отдельные колонии, сохранившие высочайшие ростовые и биосинтетические характеристики. За счет использования приспособленного штамма можно получить 0.95 гр 2Н-меченого фенилаланина с 1 литра ростовой среды. Показано, что вместе с фенилаланином штамм синтезирует и выделяет в ростовую среду в количестве 5-6 ммоль метаболически связанные с ним аминокислоты: аланин, валин и лейцин/изолейцин. Согласно данным способа масс-спектрометрии EI MS метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (Dns) производных аминокислот, 2Н-меченые аминокислоты, приобретенные микробиологическим синтезом представляли собой консистенции молекул с разным количеством включенных атомов дейтерия; уровень дейтерированности молекул определяли из масс-спектров по более всераспространенному пику молекулярного иона (M)+ каждой аминокислоты — для фенилаланина уровень дейтерированности составил 6; для аланина -3.1; для валина -4.7; для лейцина/изолейцина — 5.1 атома дейтерия.
ВВЕДЕНИЕ
В текущее время микробиологический синтез 2Н-меченых аминокислот завлекает все большее внимание исследователей вследствие только природной конфигурации синтезируемых соединений, возможностью униформного введения дейтериевой метки в молекулы аминокислот и их низкой цены по сопоставлению с химически синтезированными аналогами [1, 2]. Вот поэтому поиск новых штаммов-продуцентов 2Н-меченых аминокислот, устойчивых к высочайшим концентрациям дейтерия в ростовых средах для их предстоящего микробиологического использования является животрепещущей задачей для современной микробиологической индустрии.
С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность использовать для направленного синтеза 2Н-меченых аминокислот биологическую конверсию [U2H]MetOH в клеточках приобретенных за счет мутагенеза и генной инженерии штаммов метилотрофных микробов, ассимилирующих MetOH в качестве источника углерода и энергии по рибулозомонофосфатному (RuMP) либо сериновому пути ассимиляции углерода [3]. Продуктивность метилотрофных микробов, измеренная по уровню конверсии MetOH в клеточные составляющие добивается 50%, что делает их комфортными объектами для получения с помощью их 2Н-меченых аминокислот [4]. Обычным подходом при всем этом остаётся выкармливание метилотрофных штаммов-продуцентов аминокислот на минеральных средах с [U2Н]MetOH и наивысшими концентрациями 2Н2О [5]. Но подобные процессы пока не находят широкого внедрения в микробиологической индустрии, вследствие значимого негативного биостатического эффекта, оказываемого 75-80 об.% 2Н2О на рост многих метилотрофов [6], в то время как растительные клеточки могут нормально развиваться при концентрациях менее 50 об.% 2H2О [7], а клеточки животных менее 35 об.% 2H2О [8]. Как было показано нами преждевременное, отчасти понизить нехороший биостатический эффект 2Н2О у метилотрофов позволяет подготовительная клеточная адаптация к 2Н2О и следующее внедрение для микробиологического синтеза 2Н-меченых аминокислот приспособленных форм метилотрофных микробов [9]. Явление клеточной адаптации к 2H2О любопытно не только лишь само по себе, но оно также позволяет получать уникальный био материал, несущий дейтериевую метку, очень удачный для разнопрофильных микробиологических исследовательских работ. В соответствиие с этим, целью истинной работы было исследование процесса физиологической адаптации нового фенилаланин-продуцирующего RuMP штамма факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum к наибольшим (98% об.) концентрациям 2Н2О в ростовой среде. Так как биосинтетический потенциал данного метилотрофного штамма при росте на 2Н2О к началу проведения работы был исследован недостаточно, представляло энтузиазм исследование его возможности к микробиологическому синтезу 2Н-меченого фенилаланина и других аминокислот в критериях очень насыщенной дейтерием среды.
ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ И Способы
Объектом исследования служил приобретенный за счет мутагенеза нитрозогуанидином лейцинзависимый грам-положительный штамм RuMP факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, продуцент фенилаланина [10]. Потребость штамма в лейцине составляет 10 мг/л. Родительский штамм был получен из Всероссийской коллекции промышленных микробов (ВКПМ) Муниципального научно-исследовательского центра генетики и селекции промышленных микробов ГНИИГЕНЕТИКА.
Для изготовления ростовых сред и адаптации штамма использовали 2H2O (99.9 ат.% 2H) и [U2Н] MetOH (97.5 ат.% 2H), приобретенные из Русского научно-исследовательского центра ИЗОТОП (Санкт-Петербург, РФ). Для сотворения высочайшего градиента концентрации 2Н2О в ростовых средах использовали 2Н2О с атомным содержанием дейтерия 99.9%. Фосфатсодержащие соли были два раза перекристаллизованы в абсолютной 2Н2О перед их внедрением и высушены в вакууме. Все же, процент дейтерированности ростовых сред после стериллизации мокроватым паром, измеренный способом ЯМР был ниже на 8-10% изотопной чистоты начальной 2Н2О). По необходимости 2H2O очищали от вредных примесей, перегоняя её над перманганатом калия [11].
Выкармливание штамма проводили в минеральной среде M9 [12], приготовленой на базе разных концентраций 2Н2О (см. таблицу) с добавками протонированного лейцина и [U-2H] MetOH при 370 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с заполнением средой до 50 мл в критериях насыщенной аэрации по методике [13]. После 6-7 суток роста клеточки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В культуральной воды анализировали секретируемые аминокислоты.
Адаптацию штамма к 2Н2О проводили на агаризованных средах М9 (2%-ный агар), содержащих ступенчато растущий градиент 2Н2О (от 0 прямо до 98 об.% 2Н2О). При всем этом использовали поочередный рассев штамма до отдельных колоний и следующую селекцию колоний, выросших на средах со ступенчатом градиентом 2Н2О. Отобранный штамм хранили в 50%-ном растворе (в 2Н2О) глицерина при -140С.
Морфологию клеток изучили при помощи интерференционно-поляризационного микроскопа МБР-5 (Венгрия).
Бактериальный рост оценивали по величине оптической плотности суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 540 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм.
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) аминокислот проводили на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) в системе растворителей: изо-PrOH-аммиак, (7:3).
Секретируемый фенилаланин определяли на приборе Beckman DU-6 (США) при 540 нм в образчиках культуральной воды, объёмом 10 мкл после ее обработки 0.1% веществом нингидрина в ацетоне.
Уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли способом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70эВ, используя прямую дериватизацию лиофилизированных культуральных жидкостей дансилхлоридом и диазометаном [14].
Дальше — см.следющую статью веб-сайта.