Рост бактерии Basillus subtilis и биосинтез нуклеозида инозина
Рост бактерии Basillus subtilis и биосинтез нуклеозида инозина РОСТ БАКТЕРИИ Basillus subtilis И БИОСИНТЕЗ НУКЛЕОЗИДА ИНОЗИНА НА ВЫСОКО-ДЕЙТЕРИРОВАННОЙ СРЕДЕ
2006 г. О. В. МОСИН
Столичная муниципальная академия узкой хим технологии им. М.В. Ломоносова, 117571.
Исследована возможность биосинтетического получения дейтерий-меченного инозина оковём выделения из культуральной воды штаммапродуцента Bacillus subtillis. Способ получения инозина основан на использовании в качестве источника ростовых причин при культивировании штамма-продуцента гидролизатов дейтерированной биомассы факультативных метилотрофных микробов Brevibacterium methylicum, приобретенных со среды, содержащей 98 об.% 2Н2O и 2 об.% С2Н3О2Н. Приведены экспериментальные данные по росту штамма B. subtilis и биосинтезу инозина на среде, приготовленной из 99,9 ат.% 2Н2О и гидролизатов биомассы метилотрофных микробов. Анализ степени дейтерированности инозина был проведён с внедрением масс-спектрометрии FAB. Приобретенные результаты свидетельствуют о высочайшей степени включения дейтерия в инозин (62,5 % атомов водорода в углеродном скелете молекулы замещены на дейтерий).
Ключевики: Bacillus subtillis. — Тяжёлая вода. — Дейтерий-меченный инозин. — Масс-спектрометрия.
ВВЕДЕНИЕ
В текущее время культивирование штаммов-продуцентов на тяжеленной воде, открывает все новые способности для получения широкого круга на биологическом уровне активных соединений (БАС), в т.ч. нуклеозидов, меченных дейтерием [1-3]. В связи с этим перспективны биотехнологические процессы, в каких для роста на тяжеленной воде употребляют штаммы продуценты подходящих БАС, устойчивые к присутствию наибольших концентраций 2Н2O.
Основной трудностью при биосинтезе изотопно-меченных нуклеозидов является недочет соответственных ростовых субстратов. Начиная с первых тестов Катца с соавт. по адаптации и выращиванию клеток Chlorella на тяжеленной были разработаны среды на базе экстрактов дейтерий-меченной биомассы микроводорослей как источников ростовых субстратов для культивирования других штаммов-продуцентов БАС [4]. Но способ получения высокодейтерированных субстратов, отлично апробированный на микроводорослях в лабораторных критериях, все таки не находит широкого практического внедрения вследствие ряда проблем, связанных, а именно, с адаптацией и культивированием микроводорослей в тяжеленной воде, аппаратурной громозкостью технологической схемы, внедрением фотореакторов и т.п.
Другими другими источниками дейтерий-меченных соединений могут служить метилотрофные бактерии, энтузиазм к которым все растет благодаря удачному развитию технологии хим синтеза метанола [5]. Усваиваемость биомассы метилотрофов клеточками эукариот составляет 85-99 % [6], а производительность метилотрофов, измеренная по уровню конверсии метилового спирта добивается 50% [7]. Как было показано нами преждевременное, метилотрофные бактерии могут быть довольно стремительно и просто адаптированны к тяжеленной воде [8-10]. В связи с этим, практический энтузиазм представляет разработка на базе гидролизатов биомассы метилотрофов меченных сред для культивирования разных штаммов-продуцентов БАС, а именно нуклеозидов.
Целью данной работы было исследование принципной способности использования гидролизатов биомассы метилотрофных микробов для получения инозина, высокомеченного дейтерием.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали безводные соли марки “х.ч.”(РФ), белкововитаминный концентрат дрожжей (Пензенский завод, РФ), 2Н2О (99,9% 2Н) и С2Н3О2Н (97,5 % 2Н), приобретенные из Русского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ).
Бактериальные штаммы. Объектом исследования служил мутантный штамм B. subtilis, способный продуцировать и выделять инозин в культуральную жидкость при росте на среде, содержащей в качестве ростовых причин сухую дрожжевую биомассу, полученную на углеводородах. Штамм был получен из коллекции культур ГКПМ Русского научно-исследовательского центра генетики и селекции промышленных микробов.
B. subtillis был за ранее приспособлен к росту на тяжёлой воде оковём рассева на среде, приготовленной на базе 99,9 ат. % 2Н2О и применен в качестве продуцента инозина при ферментации. Отобранный штамм проявлял высшую жизнеспособность и стабильность по признаку инозинообразования при неоднократном пассивировании на агаризованных (2%-ный агар) средах. Штамм поддерживали на агаризованной среде, содержащей 2Н2O.
В качестве источника ростовых причин при культивировании штамма-продуцента инозина использовали штамм факультативных метилотрофных микробов B. methylicum, приобретенный в работе [8].
Сырую биомассу B. methylicum, полученную в стопроцентно дейтерированной среде dM9 [11] автоклавировали в 0,5 н. растворе 2 HCl (в 2H2O) при 08 ати в течении 30 мин.
Экстракцию липидов проводили консистенцией хлороформ-метанол (2:1) по способу Блайя и Дайера [12].
Гидролиз белка проводили в 6 н. 2 HCl (в 2H2O) (24 ч, 110 0С) [13].
Культивирование B. subtilis. Для получения посевного материала использовали среду последующего состава (в % по весу): глюкоза 2; пептон 2; бакто-витаминный концентрат дрожжей 2; NaCl 0,25.
Культивирование B. subtilis проводили на среде, приготовленной на базе 99,9 ат.% 2Н2О (dFM-среда), содержащей (в % по весу): глюкоза 12; автоклавированная биомасса метилотрофных микробов B. methylicum 2,5; NH4NO3 3; MgSO4 2; мел 2.
Среды стериллизовали при 0,8 ати. в течении 30-40 мин, рН доводили до 7,0-7,2 при помощи гидроокиси калия. Посевной материал выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (с заполнением средой менее 20 мл) в критериях насыщенной аэрации при 30-320С. После суток посевной материал переносили в ферментационную среду в количестве 5-10 об.%. и культивировали в течении 7 суток как при выращивании посевного материала.
Выделение инозина. Клеточки отделяли от культуральной воды на центрифуге Т-24 (Германия) (10 000 об/мин., 10 мин.). Супернатант концентрировали при 10 мм рт ст до объёма, вдвое меньше начального. Белки удаляли, осаждая их метанолом при -40 С, осадок отделяли центрифугированием (10 000 об/мин, 10 мин). К супернатанту добавляли 1 г активированного угля и выдерживали обскурантистскую смесь при -4 0С в течении суток. Десорбцию инозина проводили 50 %-ным веществом спирта в 25 %-ном растворе аммиака, десорбант лиофилизовали. Приобретенный продукт два раза промывали ацетоном, сушили при 500 С. Инозин перекристаллизовывали из метанола.
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) инозина производили на пластинках “Silufol UV254”(Чехо-Словакия) в системе: н-бутанол-уксусная кислота-вода, 2:1:1. Инозин идентифицировали по поглощению в УФ свете.
Содержание инозина в культуральной воды определяли на приборе “Beckman DU-6” (США) в пробах культуральной воды, объемом 10 мкл с помощью стандартной калибровочной кривой (249 нм). Элюцию пятен проводили дистиллированной водой.
Аминокислотный анализ белковых гидролизатов проводили на приборе “Biotronic LC 50001” (ФРГ), 230 x 3,2 мм, рабочее давление 50-60 атм, скорость подачи буфера 18,5 мл/ч, нингидрина 9,25 мл/ч.
Уровни включения дейтерия в аминокислоты белка были изучены способом масс-спектрометрии электрического удара на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япониня) после модификации аминокислот в метиловые эфиры дансиламинокислот по методике, обозначенной в работе [8].
Масс-спектры инозина получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) на глицериновой матрице, при потенциале 5 кВ и ионном токе 0,6-0,8 мА.