Водородный обмен на дейтерий и тритий
Водородный обмен на дейтерий и тритий
О.В. Мосин
ВОДОРОДНЫЙ ОБМЕН НА ДЕЙТЕРИЙ И ТРИТИЙ В МАКРОМОЛЕКУЛАХ БЕЛКОВ И ДНК.
При растворении многих веществ в дейтериевой (D2O) либо тритиевой (3Н2О) воде происходит обмен атомов водорода на дейтерий D либо тритий 3Н.
Изотопный обмен характеризуется как самопроизвольное перераспределение изотопов хим элемента меж разными фазами системы (а именно, меж разными агрегатными состояниями 1-го и такого же вещества), частичками (молекулами, ионами) либо снутри молекул (сложных ионов).
При изотопном обмене сохраняется постоянным элементный состав каждого участвующего в обмене вещества, меняется только его изотопный состав.
Рассредотачивание изотопов меж субстанциями в состоянии равновесия характеризуется коэффициентом рассредотачивания, определяющим соотношение сбалансированных концентраций изотопов в реагирующих субстанциях. При равномерном рассредотачивании изотопов коэффициент рассредотачивания равен 1.
Но, на практике равномерное рассредотачивание изотопов в реагирующих субстанциях происходит только для изотопов лёгких частей.
Для лёгких изотопов углерода, азота и кислорода с маленькими различиями атомных масс при достижении хим равновесия изотопного обмена каждый изотоп распределяется меж реагирующими субстанциями умеренно.
Для изотопов тяжёлых частей дейтерия и трития эта неравномерность в рассредотачивании меж некими субстанциями может достигатьсотен процентов.
Отклонение от равномерного рассредотачивания зависит не только лишь от массы изотопов, да и от хим состава веществ, меж которыми происходит изотопный обмен. Не считая того, коэффициент рассредотачивания находится в зависимости от температуры и во всех случаях по мере её увеличения приближается к 1.
Скорость протекания изотопного обмена определяется механизмом реакций. В неких случаях изотопный обмен протекает фактически одномоментно (к примеру, при ионных реакциях в растворе), в других случаях — очень медлительно либо же не происходит совсем. Для ускорения изотопного обмена так же, как и для других хим реакций, нередко употребляют разные катализаторы.
Так, при помещении молекулы в тяжёлую/тритиевую воду происходит достаточно резвый изотопный (Н-D-T)-обмен протонов на дейтерий/тритий в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Понятно, что в этих критериях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-D (С-T) могут синтезироваться de novo.
При помещении молекулы в тяжёлую/тритиевую воду происходит резвый изотопный (1Н-2H-3Н)-обмен в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Понятно, что в этих критериях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-2H (С-3H) могут синтезироваться de novo.
Не считая вышеобозначенных эффектов, вероятное изменение энергетики самой дейтериевой/тритиевой связи, что может сказаться на стабильность макромолекул. Изотопные эффекты дейтерия и трития связаны с образованием в тяжёлой/тритиевой воде конформаций молекул с другими структурно-динамическими качествами, чем конформаций, образованных с ролью водорода, и потому имеющих другую активность и био характеристики. Так, в случае с дейтерием разрыв С1H-связей может происходить резвее, чем С2H-связей, подвижность дейтерия меньше, чем подвижность протия, константа ионизации тяжёлой воды несколько меньше константы ионизации обыкновенной воды. Изотопные эффекты дейтерия и трития связаны с их увеличенной массой по сопоставлению с протием и вследствие этого с кинетикой реакций, подвижностью, энергетикой и т.д.
Аминокислоты, нуклеозиды, недлинные полипептиды, белки в конформации хаотичного клубка и одноцепочечные нуклеиновые кислоты стремительно меняют атомы водорода, связанные с атомами азота, кислорода и серы; атомы водорода, связанные с атомами углерода, обмениваются еще медлительнее.
В белках, в силу их хим параметров, способные к обмену протоны боковых групп неких аминокислот (к примеру гидрокси-группа ОН серина и амино-группа NH2 глутамина и аспарагина) обмениваются намного резвее, чем протоны пептидной связи либо амидных групп глутамина и аспарагина. Эти два класса протонов – при гидроксиаминной и амидной группах различают по рН-зависимости скоростей водородного обмена — 1-ый класс имеет минимум при рН 7, 2-ой — при рН 3. Каждый класс протонов можно подразделить по принципу степени роли протонов в образовании водородных связей.
Так как скорость водородного обмена обычно еще меньше, чем скорость образования и разрыва водородных связей (которая держит под контролем доступ растворителя к группам, участвующим в образовании водородных связей), наблюдаемая скорость водородного обмена для хоть какой группы есть произведение скорости водородного обмена на долю времени, в течение которого группа доступна растворителю. Таким макаром, если протоны группы участвует в образовании водородной связи, то это должно приводить к снижению скорости водородного обмена.
Это происходит поэтому, что протоны в данных группах подвергается действию растворителя только тогда, когда имеет место локальный разрыв водородных связей. Как следует, измеряя скорости водородного обмена для протонов открытых групп (к примеру, в мономерах) и скорости обмена для подобных групп макромолекулы, можно найти в каждый данный момент времени долю протонов этих групп, не участвующих в образовании водородных связей.
В двухцепочечных нуклеиновых кислотах обмен протонов, участвующих в образовании водородных связей, существенно облегчается при действии агента, который разрывает водородные связи. Протон, потенциально способный к резвому обмену, обменивается плохо, если он образует водородную связь.
Данный факт можно использовать для определения числа водородных связей, эффективности разных денатурирующих агентов либо динамического состояния макромолекулы. При первом применении этой методики рассматривали только дейтериевый обмен, так как 3Н2О была недосягаема. Обнаружение дейтерия было очень трудной задачей, которую решали или масс-спектрометрией, или методом инфракрасной спектрофотометрии. Как стала доступной 3Н2О, заместо дейтериевого обмена стали использовать тритиевый, так как тритий просто обнаруживать по радиоактивности.
Тритиевый обмен служит способом исследования структуры белка либо ДНК. При всем этом требуется отделение макромолекул от 3Н2О. Такового специфичного разделения можно добиться с внедрением заряженного геля, так как 3Н2О очень удерживается всеми гелями. Если поры геля имеют малый размер, макромолекулы выходят из геля без особенного труда.
Рис. 1. Опыт по тритиевому обмену в белках.
Полипролин (А) и РНазу (Б) инкубировали в течение нескольких часов в 3Н2О до заслуги наибольшего обмена. Потом эталоны растворяли водой и через разные промежутки времени наносили на колонку с сефадексом G-25 для разделения белка от 3Н2О. На графике А отсутствует тритий, ассоциированный с полипролином, из чего следует, что или водородный обмен не происходит, или он происходит очень стремительно. На графике Б показано, что в случае с РНКазой тритий связывается с белком. (из работы Englander W., Biochemistry, 2, 798-807 (1965).
Методика тритиевого обмена, в какой употребляется гель-проникающая хроматография на разных молекулярных ситах типа сефадекс (рис. 1), состоит в последующем. К белку либо нуклеиновой кислоте в растворе Н2О добавляют тритиевую воду. Через разные промежутки времени отбирают пробы и помещают их на колонку. 3Н2О очень задерживается колонкой, в то время как белки и нуклеиновые кислоты стремительно проходят через нее. Используя колонку таковой длины, что белок либо нуклеиновая кислота проходят через нее за 10 секунд, концентрацию несвязанного трития снижают примерно в 108 раз.
Потом с колонки отбирают фракции и радиоактивность каждой определяют способом сцинтилляционного счетчика; концентрацию белка либо нуклеиновой кислоты определяют спектрофотометрически либо при помощи цветных реакций на белок. Так можно измерить число обменявшихся атомов водорода, приходящееся на единицу массы либо на молекулу (если известна молекулярная масса) как функцию времени.
Способом тритиевого обмена получено несколько принципиальных результатов. К примеру, установлено, что протоны, участвующие в образовании водородных связей двухцепочечной ДНК, могут обмениваться. Из данных по кинетике изотопного обмена и сбалансированному распределению изотопов и воздействию на их рН выяснено, что водородные связи в двухцепочечной ДНК повсевременно разрушаются и образуются вновь; этот процесс окрестили «дыханием» и предположили, что он лежит в базе вероятного механизма таких процессов, как инициация синтеза ДНК и спаривание ДНК — ДНК при генетической рекомбинации.
Другой пример — определение числа водородных связей в тРНК методом измерения толики стремительно обмениваемых протонов; эти данные были использованы учёными для доказательства одной из предложенных структур тРНК.
В изотопных исследовательских работах с тяжёлой и тритиевой водой нередко употребляют способ изотопного разбавления. Пусть нужно проанализировать содержание соединения А в консистенции, которую нереально количественно разделить на отдельные составляющие.
Эту задачку можно выполнить последующим образом. К консистенции добавляют маленькое количество А, содержащего известную примесь радиоактивного изотопа. Единственное условие предстоящего анализа заключается в том, чтобы можно было хотя бы отчасти отделить из консистенции компонент А в чистом виде. Введем коэффициент разбавления, равный отношению удельной активности изотопа А до разбавления к удельной активности такого же изотопа после разбавления. Для размеренных изотопов отношение концентраций определенного изотопа до и после разбавления в почти всех случаях можно определить при помощи масс-спектрометра. Исходя из коэффициента разбавления и количества добавленного компонента А, можно высчитать концентрацию А в начальной консистенции.
Способ изотопного разбавления можно использовать, к примеру, для определения полного количества воды в организме. Для этого вводят известное количество воды, содержащей определенную примесь радиоактивного трития. Через некое время, требуемое для полного смешивания введенной воды с остальной ее частью, отбирают эталон сыворотки крови и определяют в нем удельную активность трития. Если при всем этом оказалось, что коэффициент разбавления равен, к примеру, 800, то полное количество воды в организме в 800 раз превосходит объем воды, введенной в опыте.
Способ изотопного обмена применим для многих биохимических, исследовательских и структурно-функциональных исследовательских работ макромолекул, в том числе белков и ДНК.
Литература:
Д. Фрайфельдер, Физическая биохимия, М., Мир, 1982).
О.В. Мосин, Д.А. Складнев, В.И. Швец. Биотехнология. 2001, с. 16-32