Выкармливание микробов на средах, содержащих постоянные изотопы
Выкармливание микробов на средах, содержащих постоянные изотопы
Для многих целей, и сначала для структурных исследовательских работ белков, биотехнология предлагает другой хим синтезу путь получения изотопномеченых аминокислот и белков, который приводит к высочайшим выходам синтезируемых товаров, к действенному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных товаров [55, 56]. Способ заключается в выращивании штаммов-продуцентов нужных БАС на ростовых средах, содержащих разные субстраты, представляющие из себя органические соединения и неорганические соли, содержащие постоянные изотопы 2Н, 13С, 15N и 18О [57-61].
ешающее значение для биотехнологического получения изотопномеченых аминокислот и белков имеет верный выбор микробов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих постоянные изотопы и к продукции подходящих БАС. Более доступными объектами для получения многих изотопномеченых белков признаны микроводоросли, огромное обилие которых в природе позволяет выбирать посреди их отдельные виды, способные к эндогенному скоплению белков [62]. В то же время всеохватывающее внедрение компонент меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, к примеру, [2H]аминокислоты, в том числе и гетеромеченые, из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на 2Н2O-среде [63]. Другие классические штаммы микробов также могут отлично применяться для получения изотопномеченых аминокислот и белков. При всем этом основными требованиями к микробам, применяемым для получения изотопномеченых соединений являются устойчивый рост на средах, содержащих постоянные изотопы и высочайший уровень продукции подходящих БАС, который можно повысить за счёт внедрения генно-инженерных способов, также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с данными качествами и для предстоящего исследования их черт. Биотехнологический подход экономически целесообразен и в особенности незаменим, когда нужны высочайшая стереоселективность и наибольшие уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.
При биотехнологическом получении изотопномеченых соединений употребляют несколько подходов, один из которых заключается в униформном обогащении размеренными изотопами клеточных БАС по всему углеродному скелету молекул. Это достигается за счёт выкармливания микробов на средах, содержащих меченые субстраты высочайшего уровня изотопной чистоты и с следующим фракционированием компонент биомассы на разные классы природных соединений [64]. Так, аминокислоты с униформным нравом включения изотопной метки 13С по скелету молекулы получают, в главном, при выращивании автотрофных микробов на ростовых средах, содержащих заместо обыденных углеродных субстратов только их низкомолекулярные [13С]аналоги, к примеру 13СО2 [65]. Таким методом были получены многие [13C]белки, синтезируемые микроводорослями: ферридоксин из Anabaena [66], цитохром C-553 [67], цитохром C2 из Rhodospirillum [68], и флаводоксин из Anabaena 7120 [69] и применены для последующих ЯМР исследовательских работ. Для структурных исследовательских работ белков способом спектроскопии ЯМР, для которого нужно, чтоб как можно больше атомов в молекуле были замещены на их постоянные изотопы, биосинтетические подходы по получению униформно меченых [13C]аминокислот могут обеспечить сравнимо дешевое получение подходящего количества меченых [13C]продуктов [70]. [15N]аминокислоты получают аналогичным оковём за счёт выкармливания микробов на аква средах, содержащих К15NO3 либо другие 15N-содержащие соли [71], в то время как высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с внедрением ростовых сред, содержащих заместо обыкновенной воды 99,9% 2H2O [72]. Но, при всем этом нужно учесть эффекты, связанные с клеточной адаптацией к 2Н2O. Понятно, что 2Н2О действует токсически на клеточки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микробов.
Но, невзирая на нехороший биостатический эффект 2Н2O, различные таксономические роды микробов могут быть довольно просто приспособлены к росту и биосинтезу на средах содержащих наибольшие концентрации тяжеленной воды [73], в то время как клеточки высших растений способны выдерживать менее 60% 2Н2О [74], а животные клеточки менее 30% [75]. С физиологической точки зрения и генетики адаптация клеточки к 2Н2О является всеохватывающим феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клеточки. В связи с этим, разработка способов физиологической адаптации клеточки к 2Н2О для получения высокообогащённых дейтерием БАС является очень животрепещущей [76-78]. Следует также выделить, что исследования по адаптации био объектов к 2Н2О также должны учесть хим изотопные эффекты, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высочайшими [79]. При всем этом различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей хим реакций, протекающих в 2Н2О по отношению к таким в обыкновенной воде, измеренных как соотношение kH/k2H. Это соотношение изменяется для разных связей, образованных с ролью дейтерия и может разнообразить в границах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся конфигурации в констатнах скоростей хим реакций, обусловленных действием 2Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.). Не считая того, следует держать в голове, что 2H2O является гидроскопическим соединением, интенсивно всасывающем пары воды из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и, как следует, этапы, связанные с выращиванием микробов на 2H2O-средах нужно проводить в герметических критериях с внедрением безводных реагентов, за ранее перекристаллизованных в 2Н2O неорганических солей и т. п. [18O]аминокислоты можно получать за счёт выкармливания микробов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды — H218O. Адаптация клеток к H218O в этом случае не является лимитирующим шагом. Но, H218O употребляется в качестве источника изотопной метки в редчайших случаях, приемущественно, вследствие высочайшей цены изотопных соединений кислорода [80].
Селективного включения размеренных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков можно достигнуть за счёт внедрения композиции меченых и немеченых субстратов в ростовых средах [81], меченых предшественников аминокислот [82], либо при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микробов [83]. Для этих целей прекрасно подходит такая распространённая амеба как E. coli, биосинтез аминокислот в какой к истинному времени исследован более детально и для которой получен бессчетный набор мутантных форм [84].
Очень нередко, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клеточке приводят к специфичному мечению других биосинтетически схожих аминокислот за счёт использования клеточкой бессчетных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В неких случаях этот фактор может значительно облегчить процесс получения селективно меченых белков и аминокислот. Таким методом был получен [15N]Т4-лизоцим, с селективным нравом включения метки 15N только по остаткам глутамата, глутамина и аргинина [85]. В работах [86, 87] сообщается о получении других личных [15N]белков, селективно меченных изотопом 15N по остаткам гистидина и лизина.